Диссертация (1144724), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Функционирование MtNIN после MtDMI3 было подтверждено какхарактером кальциевых осцилляций, которые не отличались от дикого типа,так и неспособностью растений Mtnin–1 формировать спонтанные клубенькипри трансформации конструкцией, содержащей MtDMI31−311. Таким образом,анализ полученных на различных видах семейства Бобовых мутантов по генуNin показал, что он занимает ведущее положение, как в развитии инфекции,так и в органогенезе клубенька (Marsh et al., 2007).
Последовательность генаPsNIN — Pssym35 — у гороха была выявлена в ходе проведения данногоисследования (см. раздел 3.4).Обзор литературы62Следует отметить, что недавно была предложена роль для MtNIN кактранскрипционногофактора,координирующегопрограммуразвитияклубенька в различных тканях корня (Vernié et al., 2015). Детально схемакоординирующей роли MtNIN будет представлена в разделе 1.1.15.2.Генетический анализ выявил у M.
truncatula 2 локуса NODULATIONSIGNALING PATHWAY 1 (MtNSP1) и MtNSP2, функционирующих послеMtDMI3 (Catoira et al., 2000; Oldroyd, Long, 2003). Мутанты по этим генамхарактеризуются наличием деформаций корневых волосков и индукциейкальциевых осцилляций при инокуляции ризобиями, при этом у нихполностью отсутствуют деления коры корня и рост инфекционных нитей(Catoira et al., 2000; Wais et al., 2000; Oldroyd, Long, 2003). Было показано, чтоэти гены кодируют транскрипционные факторы, принадлежащие к семействуGRAS, локализующиеся в ядре (Kaló et al., 2005; Smit et al., 2005).
Оба генахарактеризуются конститутивной экспрессией, причем уровень экспрессииMtNSP1 не изменяется при инокуляции ризобиями (Smit et al., 2005), аMtNSP2 — повышается (Kaló et al., 2005). У L. japonicus были выяленыортологичные гены — LjNSP1 и LjNSP2 (Heckmann et al., 2006; Murakami etal., 2006). Уровень их экспрессии повышался при инокуляции ризобиями(хотя ко 2-му дню после инокуляции наблюдался некоторый спад) (Heckmannet al., 2006). Для гена LjNSP2 была показана супрессия в зрелых клубеньках(Murakami et al., 2006).
Примечательно, что трансформация мутантовMtnsp1–1 и Ljnsp1–1 NSP-подобным геном из Nicotiana benthamiana(NbNSP1) восстанавливало у мутантов способность к клубенькообразованию,что указывает на то, что консервативные домены в белке NSP1, необходимыедля функционирования белка в сигнальном каскаде, активируемом Nodфактором, консервативны среди семейства Бобовых и растений другихсемейств (Heckmann et al., 2006). Тем не менее, комплементированныеNbNSP1клубенькиL. japonicusсодержаликлетки с аномальнымибактероидами, которые могли фиксировать азот, а M. truncatula — клетки сОбзор литературы63редкими бактероидами, неспособными к фиксации азота. Это указывает нато, что NSP1 вовлечен не только в процесс инфекции клубенька, но и впроцессы выхода бактерий из инфекционных нитей и формированиябактероидов (Heckmann et al., 2006).
У гороха был выявлен ортолог генаMtNSP2 — PsSym7 (Kaló et al., 2005; Dolgikh et al., 2011), Pssym34 являетсяортологом гена MtNSP1 (Shtark et al., 2016). Было показано, что MtNSP1 иMtNSP2 формируют комплекс, который ассоциирован с промоторами геновранних нодулинов (в частности с геном MtENOD11). In vitro MtNSP1связывается с промотором MtENOD11 через цис-элемент AATTT, однако invivo такая ассоциация требует участия MtNSP2 (Hirsch et al., 2009). У MtNSP1домены LHRI и LHRII вовлечены в связывание с ДНК, а у MtNSP2 доменLHRI необходим для связывания с MtNSP1.
Более того, комплекс MtNSP1 иMtNSP2 активирует промоторы MtNIN и гена еще одного транскрипционногофактора — MtERN (Hirsch et al., 2009). Таким образом, регуляция промотораNIN является комплексной и включает регуляцию как CYCLOPS, так икомплексом NSP1 и NSP2, что возможно приводит к синергичному эффектув регуляции (Рисунок 6) (Downie, 2014).Мишень комплекса MtNSP1 и MtNSP2 — транскрипционный факторERF REQUIRED FOR NODULATION (ERN) принадлежит к семейству ERF(ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR), содержащемувысококонсервативный ДНК-связывающий домен AP2, (Middleton et al.,2007). Мутации по гену MtERN приводят к блоку развития инфекции послеформирования микроколонии ризобий в скрученном корневом волоске, хотяизредка инфекционные нити инициируются, но они абортируются вкорневом волоске.
Тот факт, что трансформация мутантных растений по генуMtERN конструкцией MtDMI31–311, приводящей к автоактивации CCaMK,не приводит к формированию спонтанных клубеньков, указывает нафункционирование гена MtERN в органогенезе клубенька (Middleton et al.,2007).Обзор литературы64Недавно был выявлен еще один компонент сигнального пути,активируемого Nod-факторами, который участвует в активации генов,контролирующих процессы инфекции и органогенеза клубенька — белкиDELLA (Jin et al., 2016). DELLA известны как репрессоры транскрипции, чьядеградация 26s протеосомным комплексом индуцируется гиббереллиновойкислотой (Feng et al., 2008).
Действительно, обработка растений M. truncatulaгиббереллиновой кислотой приводила к снижению числа клубеньков иинфекционных нитей. Растения с выключенными в результате РНКинтерференции 3-мя генами MtDELLA, а также инсерционные мутантыMtDELLA1, MtDELLA2 и MtDELLA3 формировали сниженное числоклубеньков,указываянапозитивнуюрольMtDELLAвклубенькообразовании (Jin et al., 2016). Было показано, что MtDELLA,взаимодействуя с MtIPD3, может формировать комплекс MtDMI3–MtIPD3–MtDELLA (Рисунок 6). При этом MtDELLA могут усиливать взаимодействиемежду MtDMI3 и MtIPD3, что приводит к более высокому уровнюфосфорилирования MtIPD3 посредством MtDMI3.
Было показано, что уMtIPD3 фосфорилирование двух аминокислотных сериновых остатков S50 иS155 является необходимым для симбиоза. Фосфоаблятивная мутантнаяверсияMtIPD3S50A–S155Aнебыласпособнакомплементироватьмутантный фенотип Mtipd3–2, в то время как фосфомиметическая версияS50D–S155DполностьюкомплементировалаMtipd3–2.Приэтомфосфоаблятивная мутантная версия MtIPD3 S50A–S155A не была способнавзаимодействовать с белками MtDELLA, а фосфомиметическая версия S50D–S155D усиливала это взаимодействие.
Также было показано, что MtDMI3может в дальнейшем усиливать взаимодействие MtIPD3 и белков MtDELLA,подтверждая, что сборка комплекса MtDMI3–MtIPD3–MtDELLA может бытьактивирована MtDMI3 во время развития симбиоза (Jin et al., 2016). Болеетого, MtDELLA могут активировать комплекс транскрипционных факторовMtNSP2–MtNSP1, взаимодействуя с белком MtNSP2 (Jin et al., 2016). СайтыОбзор литературы65связывания MtIPD3 (CYC-бокс) и MtNSP1 (NRE-бокс) с промотором генаMtNINнаходятсярядомдругсдругом,чтоделаетвозможнымвзаимодействие MtDMI3–MtIPD3 и MtNSP2–MtNSP1. Действительно, белкиMtDELLA способны связывать белковые комплексы, содержащие MtIPD3 иMtNSP2 (Рисунок 6) (Jin et al., 2016).Таким образом, было показано, что сигнальный путь, активируемыйдействием Nod-факторов, включает в себя серию этапов (Рисунок 6). Послеузнавания рецепторными комплексами Nod-факторов, сигнал передается вядро, где с помощью специфичных калиевых и кальциевых каналов, а такженуклеопориновиндуцируютсякальциевыеосцилляции,которыедекодируются CCaMK, в результате чего при взаимодействии рядатранскрипционных факторов активируется транскрипционый фактор NIN,запускающий программу развития инфекции и развития клубенька.
Важноотметить, что многие компоненты описанного сигнального пути вовлеченытакже в развитие другого, более древнего эндосимбиоза — арбускулярноймикоризы (Oldroyd, 2013), который не будет рассматриваться в данномобзоре.1.1.6. Инициация и рост инфекционной нитиСкручивание корневого волоска приводит к тому, что внутри негооказывается заключенной ризобия. Она активно делится, что приводит кформированию микроколонии, которая, в свою очередь, развивается внутриинфекционной камеры (кармана), постепенно увеличиваясь в размере, чтосопровождается перестройкой инфекционной камеры.
У M. truncatula вовремя перестройки наблюдается аккумуляция маркера экзоцитоза — белкаVesicle-Associated Membrabe Protein 721e (MtVAMP721e) (Рисунок 10)(Fournier et al., 2015). Транспорт везикул к мембране, окружающейинфекционную камеру, начинается спустя несколько часов после завершенияскручиваниякорневоговолоска.АккумуляцияассоциированногосОбзор литературы66инфекцией секреторного белка MtENOD11 вокруг заключенных в камереризобий (Рисунок 10), вероятно, связана с обеспечением пластичностиклеточнойстенки,необходимойдлярадиальногорасширенияипоследующей инициации полярного роста инфекционной нити (Fournier etal., 2015).
Ранее было показано, что богатый пролином белок MtENOD11является атипичным для клеточной стенки, посколько содержит сниженноеРисунок 10. — Реконструкция инфекционной камеры подготавливаетпуть для инициации и полярного роста инфекционной нити в клеткекорневого волоска M. truncatulaСхематично изображены маркер экзоцитоза и белок MtENOD11 вовремя скручивания корневого волоска, перестройки инфекционной камеры иинициации роста инфекционной нити. (А — В) Во время скручиваниякорневого волоска сайт экзоцитоза в кончике растущего корневого волоска,меченный GFP–VAMP721e (А и Б), исчезает, как только скручиваниезавершается (В).
На этой стадии в инфекционной камере обычно заключенаодна ризобиальная клетка. (Г — Е) Перестройка инфекционной камерыначинается перед значительным увеличением количества ризобий (Г) и ведетк увеличению и дифференцировке нового компартмента, ассоциированного сразмножением ризобий (Д) до начала инициации роста инфекционной нити(Е). Ризобии изображены розовым цветом, GFP–MtVAMP721e — зеленым,YFP–MtENOD11 — желтым (Fournier et al., 2015).Обзор литературы67количество тирозина, что, вероятно, ограничивает перекрестное связывание сдругими клеточными компонентами (Journet et al., 2001).
Постоянноеоткладывание нового мембранного и внеклеточного материалов, включаяMtENOD11, в период c 10 до 20 часов после скручивания корневого волоскаведет к радиальному увеличению камеры и превращению ее в глобулярный,подобный инфекционной нити, компартмент (Fournier et al., 2015). При этомдля такого рода перестройки необходима активность гена MtNIN, посколькумутант Mtnin–1 не был способен инициировать перестройку инфекционнойкамеры.Такимобразом,инициацияинфекционнойнитидолжнарассматриваться, как концевой рост расширения, образующегося изподобного инфекционной нити компартмента (Fournier et al., 2015).Инициация роста инфекционной нити сопровождается перестройкойэлементов цитоскелета и движением ядра в клетке корневого волоска.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
