Диссертация (1144724), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Можно было ожидать, что мутанты по генам,кодирующим рецепторы Nod-факторов, будут характеризоваться ярковыраженными фенотипическими проявлениями — отсутствием каких-либоответов на действие Nod-фактора. При исследовании M. truncatula быливыявлены мутанты по локусу Nod factor perception (Mtnfp), которые послеобработки растений экзогенными Nod-факторами не проявляли никакихответных реакций (Amor et al., 2003). У L. japonicus были выявлены двалокуса, мутации по которым приводили к сходному фенотипу с мутациямипо локусу Mtnfp.
Данные гены, получившие обозначение Nod factor receptorkinase 1 и 5 (LjNfr1 и LjNfr5) были клонированы. Они кодируюттрансмембранныесерин/треонинрецептор-подобныекиназысвнеклеточными доменами, содержащих три LysM-мотива (Madsen et al.,2003; Radutoiu et al., 2003). Лишь относительно недавно были полученыданные, подтверждающие связывание LjNfr1 и LjNfr5 с Nod-факторамиОбзор литературы43(Broghammer et al., 2012).
Было показано, что MtNFP является ортологом генагороха PsSym10 и они также кодируют серин/треонин рецептор-подобныекиназы (Arrighi et al., 2006). LysM-мотивы способны связывать соединения,содержащие N-ацетилглюкозамин (Buist et al., 2008), что подтверждаетвозможность рассматривать выявленные киназы в качестве возможныхрецепторов Nod-факторов (Fliegmann, Bono, 2015). У M. truncatula былвыявлен еще один ген, кодирующий предполагаемый рецептор Nod-фактора— MtLYK3 (Limpens et al., 2003), а у гороха его ортолог PsSym37 (Zhukov etal., 2008). У MtNFP и LjNFR5 киназные домены не активны и не способны кавтофосфорилированию (Madsen et al., 2003; Arrighi et al., 2006; Madsen et al.,2011), в то время как MtLYK3 и LjNFR1 являются активными киназами(Mbengue et al., 2010; Madsen et al., 2011) (Рисунок 5).
Было высказанопредположение,чтовыявленныебелкиформируютгетеродимерныерецепторные комплексы: LjNFR1 и LjNFR5 у L. japonicus, MtNFP и MtLYK3у M. truncatula, PsSym10 и PsSym37 у гороха (Oldroyd, 2013).Рисунок 5. — Схематичное представление двух типов LysM-богатыхрецептор-подобных киназПоказан внеклеточный домен, состоящий из 3 лизиновых мотивов(LysM), связанных посредством трансмембранного домена либо сэнзиматически активным цитоплазматическим серин/треонин киназнымдоменом (А), как, например, у MtLYK3, либо с неактивным киназнымдоменом (B), таким как у MtNFP, лишенным фосфат-связывающей петли иактивационной петли и несущим модификацию значимого мотива (NFGвместо DFG) (Fliegmann, Bono, 2015).Обзор литературы44У L.
japonicus оба рецептора: LjNFR1 и LjNFR5 одинаково важны какдля ранних ответов растения на действие Nod-фактора (скручиваниекорневых волосков, активацию делений в коре корня), так и для развитияинфекции (Madsen et al., 2003; Radutoiu et al., 2003). Тем не менее, впоследние годы появились данные, указывающие на различную роль обоихрецепторов в контроле инфекции, что предполагает наличие дополнительныхрецепторов (Fliegmann, Bono, 2015).У M. truncatula, в отличие от L. japonicus, различия между рецепторамибыли выявлены сразу при анализе мутантов в соответствующих генах. Так,мутанты по гену Mtnfp, как уже было отмечено, были полностью лишеныпроявления ответных реакций на действие Nod-фактора (Amor et al., 2003), вто время как у мутантов по гену Mtlyk3 проявлялись ранние ответы надействие Nod-фактора, но блокировалось развитие инфекционного процесса(Catoira et al., 2001; Limpens et al., 2003).
Ранее было показано, что у люцерныпроявление ранних ответов и развитие инфекции определяется различнымикомпонентами Nod-фактора (Ardourel et al., 1994). Так, наличие сульфата навосстанавливающем конце необходимо для активации ранних ответов, адополнительныемодификациинаневосстанавливающемконце(О-ацетилирование и тип жирной кислоты) необходимы для развитияинфекции. Это позволило сформулировать гипотезу о существовании двухрецепторов: «сигнального», контролирующего ранние ответы и рецептора«проникновения», контролирующего процесс инфицирования (Ardourel et al.,1994). На роль «сигнального» рецептора хорошо подходил MtNFP, а на рольрецептора «проникновения» — MtLYK3.
Однако, учитывая, что MtNFP неявляется активной киназой, было предположено, что он выполняет своифункции «сигнального» рецептора в комплексе с еще невыявленнымрецептором (Fliegmann, Bono, 2015).Наличие двух сигнальных путей, активируемых разными рецепторами,было подтверждено существованием помимо кальциевых осцилляций вокругОбзор литературы45ядра, осцилляций кальция в кончике корневого волоска, которые былисвязаны с развитием процесса инфекции (Miwa et al., 2006). Было показано,что активация обоих путей зависит от MtNFP, что позволило предположить,что MtNFP формирует комплекс с MtLYK3, выполняя функции рецептора«проникновения» (Morieri et al., 2013).Предполагается, что у гороха комплекс PsSym10 и PsSym37 выполняетфункцию рецептора «проникновения» (Zhukov et al., 2008), а комплексPsSym10 с рецептор-подобной киназой PsК1 — «сигнального» рецептора(Zhukov et al., 2008; Долгих et al., 2017).1.1.5.
Первичные этапы сигнального пути, активируемого NodфакторамиПомимо описанных ранее рецепторов на плазматической мембранетакже локализуется рецептор-подобная киназа с богатыми лейциномповторами (LRR, от англ. Leucine-rich repeat), кодируемая генами DOES NOTMAKE INFECTION2 (MtDMI2) у M. truncatula (Endre et al., 2002) иSYMBIOSIS RECEPTOR-LIKE KINASE (LjSYMRK) у L. japonicus (Stracke et al.,2002).
У гороха ортологом этих генов является ген PsSym19 (Schneider et al.,1999; Stracke et al., 2002). Данный рецептор должен функционироватьпозднее рецепторов к Nod-фактору, т.к. у мутантов по этим генамсохраняются некоторые ответы на действие Nod-факторов, такие какдеформации корневых волосков (Catoira et al., 2000).
Тем не менее, лиганд,связывающийся c внеклеточным доменом данной киназы, не был выявлен, иее роль остается до конца не ясной (Downie, 2014).Важную роль в рецепции Nod-факторов играют и другие компонентысигнального пути. Так, в клубеньках M. truncatula уже через сутки послеинокуляции значительно усиливается экспрессия гена SYMBIOTIC REMORIN1 (MtSYMREM1) (Lefebvre et al., 2010). Подавление экспрессии этого гена спомощью РНК-интерференции приводило к формированию аномальныхОбзор литературыклубеньковсредуцированной46меристемой,приэтомнаблюдалосьувеличение числа инфекционных нитей, которые сильно ветвились,формировали мешкоподобные структуры (от англ. sac), но абортировались внаружных слоях коры корня.
Все это указывает на потерю инфекционныминитями способности к полярному росту. Транспозоновые мутанты по генуMtSYMREM1 также формировали аномальные клубеньки, в которыхнаблюдалось увеличение зоны инфекции (зональность клубенька будетдетально рассмотрена позднее в разделе 1.1.13), а также нарушен выходбактерий в цитоплазму растительной клетки (Lefebvre et al., 2010).
Былопоказано, что MtSYMREM1 присутствует в особых микродоменах —«липидных рафтах» — мембран инфекционной нити в зоне инфекции, атакже вокруг симбиосомных мембран в зоне азотфиксации. Было такжевыявлено, что MtSYMREM1 взаимодействует с MtNFP, MtLYK3 и MtDMI2,что предполагает, что MtSYMREM1 является адапторным («скаффолд», отангл. scaffold) белком, который определяет пространственную регуляциюрецепторных комплексов во время развития клубенька (Lefebvre et al., 2010).Наряду со специфичным для симбиоза реморином MtSYMREM1 быливыявленыдвафлотиллин-подобныхбелка(MtFLOT2иMtFLOT4),экспрессия генов MtFLOT2 и MtFLOT4 значительно усиливается через одиндень после инокуляции растений (Haney, Long, 2010). Для активацииэкспрессии этих генов недостаточно только действия Nod-факторов, нонеобходим дополнительный невыявленный бактериальный сигнал. MtFLOT4преимущественно локализуетсяв кончикахкорневых волосков приинокуляции S.
meliloti, что возможно связано с его ролью в полярном ростеинфекционной нити (Haney, Long, 2010). Выключение генов MtFLOT2 иMtFLOT4 уменьшало число инфекционных нитей, при этом увеличивалосьчисло абортированных нитей. Было высказано предположение, что MtFLOT2и MtFLOT4 вовлечены в первичную инвагинацию инфекционной нити вОбзор литературы47клетке корневого волоска, а MtFLOT4 необходим еще и для ростаинфекционной нити (Haney, Long, 2010).Было показано, что в корневых волосках MtLYK3 и MtFLOT4локализуются независимо в отсутствии ризобий, но колокализуются приинокуляции, при этом наблюдается их стабилизация в мембране.
Следуетотметить, что позднее MtLYK3 локализуется в мембране инфекционнойнити, что указывает на его возможную роль в развитии инфекции (Haney etal., 2011).В целом можно предположить, что MtLYK3 компартментализуется влипидных рафтах, возможно, взаимодействуя с MtSYMREM1, MtFLOT2 иMtFLOT4. Такого рода компартментализация может быть необходима длясоздания условий для формирования рецепторного комплекса, узнающегоNod-фактор, или для усиления интенсивности сигнала от рецептора,вызывающего ответные реакции на действие Nod-фактора (Oldroyd, 2013).Как уже ранее отмечалось, рецептор-подобная киназа с богатымилейцином повторами MtDMI2 функционирует на более поздней стадии, чемMtNFP и MtLYK3.
Было показано, что MtDMI2 взаимодействует с3-гидрокси-3-глутарил кофермент A редуктазой 1 — ферментом биосинтезамевалоната. Выключение гена MtHMGR1, кодирующего этот фермент, спомощью РНК-интерференции приводило к нарушениям в развитииинфекционного процесса и клубенька в целом (Kevei et al., 2007). Также былопоказано, что выключение MtHMGR1 влияло на ядерные кальциевыеосцилляции.
При этом экзогенная обработка мевалонатом восстанавливалакальциевые осцилляции у растений с выключенным геном MtHMGR1, атакже у мутантов по гену MtDMI2, но не у мутанта по гену MtDMI1,блокированного на более поздней стадии развития, и кодирующегорасположенный на ядерной мембране калиевый канал, необходимый дляактивации кальциевых осцилляций (Venkateshwaran et al., 2015). ТакимОбзор литературы48образом, можно предположить, что активация MtDMI2 при инокуляциирастений ризобиями может временно активировать 3-гидрокси-3-глутарилкофермент A редуктазы 1, что приводит к усилению продукции мевалоната вэпидермальных клетках корня. В свою очередь, мевалонат являетсявторичным мессенджером, передающим сигнал от компонентов сигнальногопути, расположенных на плазматической мембране к ядру, приводя кгенерации внутриядерных и перинуклеарных кальциевых осцилляций(Рисунок 6) (Venkateshwaran et al., 2015). Наличие кальциевых осцилляцийкак в нуклеоплазме, так и в цитоплазме вокруг ядра позволилопредположить, что просвет эндоплазматического ретикулума и просветядерной оболочки являются источниками кальция при генерации осцилляций(Oldroyd, Downie, 2006).
Как уже упоминалось, важную роль в генерациикальциевых осциляций играет расположенный на внешней ядерной мембранекалиевый канал MtDMI1 (Рисунок 6) (Ané et al., 2004; Riely et al., 2007),кодируемый у гороха ортологичным геном PsSym8 (Edwards et al., 2007). В тоже время у L. japonicus имеются два ортолога MtDMI1: LjCASTOR иLjPOLLUX, кодирующие калиевые каналы, для которых первоначально былапоказана локализация не в ядре, а в пластидах. Важно отметить, что, хотяLjCASTOR и LjPOLLUX являются гомологами, они не способны заменитьдруг друга и мутанты по какому-либо из генов LjCASTOR и LjPOLLUXхарактеризуются блоком развития на стадии скручивания корневыхволосков, что может свидетельствовать, что кодируемые ими белкиформируюткомплекс(Imaizumi-Anrakuetal.,2005).Позднеесиспользованием специфичных антител была показана иммунолокализацияLjCASTOR в ядерной оболочке, там же предполагается локализацияLjPOLLUX (Charpentier et al., 2008).Обзор литературы49Рисунок 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
