Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 7

Они вовлечены с биосинтез углеродного скелета Nod-фактора. nodCкодирует хитоолигосахарид-синтазу, которая синтезирует олигомеры Nod-Обзор литературы36фактора (Debellé et al., 1992). Белок NodB деацетилирует терминальныйневосстанавливающий ацетилглюкозамин (John et al., 1993), а NodAприсоединяет к этому глюкозамину жирную кислоту (Atkinson et al., 1994).В то же время ризобии различаются по набору «генов хозяйскойспецифичности», которые вовлечены в модификацию Nod-фактора.

ХотягеныnodFE(кодирующиекетоацетилсинтазуиацилтрансферазу,соответственно) присутствуют у всех видов ризобий, тем не менее, ониконтролируют у различных видов ризобий биосинтез различных жирныхкислот, присоединяющихся к невосстанавливающему концу Nod-фактора(Demont et al., 1993). Некоторые гены присутствует только у ризобийопределенного вида. Так, ген nodH, кодирующий сульфотрансферазу,переносящую сульфат на восстанавливающий конец Nod-фактора, имеетсятолько у S.

meliloti. Наличие сульфата обеспечивает способность S. melilotiформировать клубеньки на корнях люцерны (Medicago spp.). Штамм S.meliloti, продуцирующий Nod-факторы без сульфата на восстанавливающемконце, теряет способность заражать люцерну, но приобретает способностьзаражатьвикуфукозилирование,(Rocheetвстречаетсяal.,1991).толькоГену B.nodZ,japonicum,определяющийобусловливаяспособность этих бактерий к симбиозу только с сиратро (Macroptilium)(Denarie et al., 1996). Белок NodX, кодирующий О-ацетилтрансферазу,ацетилирует Nod-фактор R. leguminosarum bv.

viciae, что приводит кспособности ризобий заражать генотипы гороха из Афганистана, несущихаллель PsSym2А (Davis et al., 1988; Firmin et al., 1993). Аналогичный результатможет быть достигнут, если в том же положении у Nod-фактора будетприсутствовать фукозил, в результате активности гена nodZ, введенного вштамм R. leguminosarum bv. viciae (Ovtsyna et al., 1998; Ovtsyna et al., 2000).Гены nodI и nodJ кодируют белки, участвующие в секреции Nodфакторов в окружающую среду (Cárdenas et al., 1996).Обзор литературы37Рисунок 2.

— Структура Nod-факторовNod-факторы, продуцируемые S. meliloti, R. leguminosarum bv. viciae,M. loti, показаны в виде скелета из остатков β-1-4-N-ацетил-D-глюкозамина(обозначен черным цветом) с N-связанными жирными кислотами(обозначены зеленым цветом) и другими хозяйско-специфичнымизаместителями (обозначены красным цветом). Каждый вид продуцируетмножество различных Nod-факторов, например, число остатков глюкозаминаможет быть четыре или пять, цепи жирных кислот (1) Nod-факторов из S.meliloti и R. leguminosarum bv.

viciae могут быть C18:1 вместо C16:2 и C18:4,как показано, и не все факторы обязательно несут все хозяйско-специфичныезаместители. Мутанты S. meliloti и R. leguminosarum bv. viciae,продуцирующие Nod-факторы, лишенные ацетильной группы (2) наацетилированном глюкозамине и несущие C18:1 жирную кислоту (мутантыпо генам nodL и nodFE, соответственно) неспособны инфицировать корни, носпособны индуцировать сигнальные ответы бобовых растений. Ацетильнаягруппа (3) у Nod-фактора R. leguminosarum bv. viciae добавляется белкомNodX и делает способными к инфекции генотипы гороха из Афганистана,несущих аллель PsSym2А (Oldroyd, Downie, 2008).Обзор литературы38Необходимо отметить, что ризобии производят не один Nod-фактор, анабор различных Nod-факторов.

Так, например, штамм NGR234 производит18 различных Nod-факторов, что совпадает с его способностью формироватьклубеньки на бобовых растениях из 112 различных родов (Price et al., 1992;Pueppke, Broughton, 1999).1.1.3. Первичные ответы растения на действие Nod-факторовОчищенныеNod-факторыризобийактивнывнаномолярныхконцентрациях, вызывая ряд физиологических и морфологических реакцийрастения, сходных с реакциями, протекающими при заражении корнейризобиями.

Самой ранней из наблюдаемых реакций макросимбионта надействие Nod-фактора S. meliloti у растений Medicago sativa L. являетсядеполяризация мембраны клетки корневого волоска, которая наблюдаетсячерез 30–60 сек (Ehrhardt, Atkinson, 1992). Она вызывается потоком ионовCa2+ внутрь клетки, а также выходом ионов Cl− (Felle et al., 1998). Спустянесколько минут наблюдаются характерные осцилляции ионов Ca2+ в районеклеточной цитоплазмы, расположенной рядом с ядром (Ehrhardt et al., 1996)(Рисунок 3). Помимо люцерны, кальциевые осцилляции в ответ на действиеNod-фактора наблюдались в корневых волосках у различных видов бобовыхрастений: M. truncatula (Wais et al., 2000), P. sativum (Walker et al., 2000), втоже время они не наблюдалась у растений томатов (Lycopersicon esculentumMill.) (Ehrhardt et al., 1996).

Таким образом, осцилляции внутриклеточногокальция, в клетке корневого волоска в ответ на действие Nod-фактора,являются специфической симбиотической реакцией макросимбионта.Позднее было показано, что Nod-факторы вызывают кальциевыеосцилляции не только вокруг ядра, но и внутри него (Sieberer et al., 2009).Интересно отметить, что у растений Vicia sativa L. и L. japonicus кдействию Nod-факторов чувствительны только клетки из зоны молодыхкорневых волосков (Heidstra et al., 1994; Niwa et al., 2001), в то время как уОбзор литературы39растений M. truncatula чувствительны как молодые, так и зрелые корневыеволоски (Catoira et al., 2000).Рисунок 3.

— Клетка корневого волоска, в которой происходятосцилляции ионов Ca2+В данную клетку был введен краситель, чувствительный к Ca2+, и онабыла обработана 10−9 М Nod-фактора. Краситель присутствует как вцитоплазме, так и в нуклеоплазме. Кривая показывает изменения в уровнеCa2+, оцененные по уровню флуоресценции красителя в течение 10 мин.Каждое фото показывает клетку на различных стадиях кальциевыхосцилляций. Большинство изменений в уровне Ca2+ происходят в областивокруг ядра, которая показана желтым цветом.

Появление красного цветасоответствует усилению флуоресценции, вызванного увеличением уровняCa2+ во время осцилляции (Oldroyd, Downie, 2006).Первымиморфологическимиизменениями,наблюдаемымипридействии на бобовые растения Nod-факторов, являются деформации искручивания корневых волосков (Рисунок 4). Они сопровождаются активнойреорганизацией актинового и тубулинового цитоскелета. В растущемкорневом волоске пучки актиновых микрофиламентов обеспечивают токцитоплазмы и экзоцитоз везикул в его кончике, они проходят среди тяжейцитоплазмы, тянущихся вокруг центральной вакуоли от основания волоска кего кончику (de Ruijter et al., 1999; Miller et al., 1999; Voigt et al., 2005).

ВОбзор литературы40одном из исследований было показано, что актиновые микрофиламенты,приближаясь к кончику корневого волоска, утончались, образуя сеть тонкихфиламентов (FB актин), при этом в самом кончике наблюдалась свободная отактиновыхмикрофиламентовзона(Milleretal.,1999).Вдругихисследованиях в самом кончике корневого волоска была выявленадинамичная система актиновых микрофиламентов (Baluška et al., 2000; Voigtet al., 2005).

Было показано, что воздействие Nod-фактора приводило кдеполимеризации актиновых микрофиламентов в кончике корневого волоска,однако, несмотря на продолжавшееся действие Nod-фактора, актиновыйцитоскелет восстанавливался через 30–60 мин (Cárdenas et al., 1998). В то жевремя более поздние исследования выявили отсутствие нарушений в токецитоплазмы,которыйопределяетсяфункционированиемактиновогоцитоскелета, при действии Nod-факторов (Sieberer, Emons, 2000), чтопоставило под сомнение деполимеризацию актиновых микрофиламентов.Другие исследователи наблюдали через 3–5 мин после добавления Nodфактора увеличениечисла пучков актиновых микрофиламентов.ВРисунок 4.

Скручивание корневого волоскаформирующемся вздутии корневого волоска не наблюдается полярный рост,поскольку пучки актиновых микрофиламентов располагаются в различныхОбзор литературы41направлениях (Miller et al., 1999). В одном из участков вздутия происходитнакопление актина, а в дальнейшем в этом месте начинается новый росткорневоговолоска,вкоторомсохраняетсяорганизацияактиновыхмикрофиламентов, свойственная растущему корневому волоску (Miller et al.,1999). Аккумуляция актина в кончиках корневых волосков наблюдаласьчерез 30 мин после обработки растений L. japonicus очищенным Nodфактором или инокуляцией ризобиями (Yokota et al., 2009).Все стадии роста корневого волоска сопровождаются формированиемгустой сети кортикальных микротрубочек, расположенных параллельнопродольной оси клетки. При этом в растущем корневом волоскемикротрубочки не достигают его кончика, и лишь после остановки ростакорневого волоска микротрубочки сходятся в его кончике (Timmers et al.,2007).Кончиккорневоговолоскасоединенсядромчерезсетьэндоплазматических микротрубочек (Sieberer et al., 2005).

В растущихкорневых волосках действие Nod-фактора вызывало изменения в сетиэндоплазматических микротрубочек, которая, тем не менее, через 10 минвосстанавливалась, при этом Nod-факторы не влияли на организациюкортикальных микротрубочек. В корневых волосках, которые прекратилисвой рост, после добавления Nod-факторов происходила деполимеризацияэндоплазматических микротрубочек, которые снова полимеризовалисьспустя 20 мин, в то же время кортикальные трубочки также не изменялись.Такиеволоскивдальнейшемформироваливздутия,изкоторыхактивировался новый рост корневого волоска под определенным углом кпредыдущему вектору роста (Sieberer et al., 2005). Таким образом,деполимеризацияэндоплазматическихмикротрубочек,вызываемаядействием Nod-фактора, коррелировала с потерей полярного роста кончикомкорневого волоска, а их полимеризация с появлением нового направленияполярногороста.Скручиваниекорневоговолоскапредшествуетдальнейшему этапу инфекции — формированию инфекционной нити,Обзор литературыспециальнойризобийтубулярнойвнутрькорня42структуры,(Brewin,обеспечивающей2004).Детальнопроникновениепроцессразвитияинфекционной нити будет рассмотрен позднее (см.

раздел 1.1.6).Параллельно с активацией инфекционного процесса в коре корнянаблюдаются деления клеток, дающие начало клубеньковому примордию(Hirsch, 1992).Этот процесстакже будетдетальнорассмотрен впоследующих разделах (см. раздел 1.1.8).1.1.4. Рецепция Nod-факторов растением-хозяиномОчевидно, что продукция ризобиями Nod-факторов в наномолярныхконцентрациях требует их восприятие растением-хозяином при помощиспецифических рецепторов. Несмотря на то, что Nod-факторы быливыявлены в конце 80-х годов прошлого века, идентификация их рецепторовоказалась трудоемкой задачей. Значительные успехи были достигнутыблагодаряиспользованиюгенетическогоподходасиспользованиеммодельных бобовых растений.