Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 9

— Сигнальный путь индукции развития симбиотическогоклубенькаNod-факторы узнаются рецепторным комплексом, представленнымLysM-богатыми рецепторными киназами NFR1 и NFR5 и LRR-содержащейрецепторной киназой SYMRK (DMI2 у M. truncatula). Активациясигнального пути ведет к окислительному взрыву и притоку кальция черезплазматическую мембрану. NADPH оксидаза RBOH и локализованный наплазматической мембране кальциевый канал, вовлеченные в сигнальныйпуть еще не выявлены. Узнавание Nod-факторов также активируеткальциевые осцилляции в ядре.

3-гидрокси-3-глутарил кофермент Aредуктаза 1 (HMGR), ассоциированная с SYMRK, вовлечена в продукциюмевалоната, который может функционировать как вторичный мессенджер вядре. Несколько каналов, локализованных в ядерной мембране,координируют выход кальция из просвета ядерной оболочки иэндоплазматического ретикулума: комплекс DMI1 (POLLUX у L. japonicus) иCNGC15 регулируют противоток калия и кальция, позволяя этим ионампередвигаться без нарушения полярности мембраны, кальциевая АТФ-азаОбзор литературы50MCA8 возвращает кальций обратно в просвет ядерной оболочки. Кальциевыеосцилляции в ядре активируют CCaMK, которая фосфорилирует CYCLOPS,чтобы стимулировать экспрессию симбиотических генов. CYCLOPS можетбыть частью большого комплекса, который содержит членов GRAS-доменсодержащих транскрипционных факторов (NSP1, NSP2 и DELLA), такженеобходимых для экспрессии симбиотических генов (Zipfel, Oldroyd, 2017).Иммунолокализация с использованием антител против GFP в корнях,несущихслияниеMtDMI1:GFP,позволилалокализоватьMtDMI1преимущественно на внешней ядерной мембране (Capoen et al., 2011).Предполагается, что MtDMI1, LjCASTOR и LjPOLLUX могут генерироватьградиент K+ через внутреннюю и/или внешнюю ядерную мембраны, которыйзапускает открытие потенциал-зависимого кальциевого канала в ядернойоболочке (Charpentier et al., 2008).На наш взгляд, следует отметить, что история с LjCASTOR иLjPOLLUXявляетсяпоказательнымпримеромтого,чтоширокораспространенное в данное время использование трансгенных линийне является универсальным методом исследования локализации белков.Более того он требует критического отношения к полученным с его помощьюрезультатам во избежание появления артефактов, как это наблюдалось припервичной локализации LjCASTOR и LjPOLLUX в пластидах (ImaizumiAnraku et al., 2005).Поскольку генерация кальциевых осцилляций требует выхода кальцияиз просветов эндоплазматического ретикулума и ядерной оболочки, былпроведен поиск компонентов, участвующих в транспорте кальция изнуклеоплазмы и перинуклеарной цитоплазмы обратно в вышеназванныекомпартменты.

В результате была выявлена кальциевая АТФ-аза (MCA8),которая, как было показано с использованием специфических антител,располагается как на внешней, так и на внутренней мембранах (Рисунок 6)(Capoen et al., 2011). Следует отметить, что РНК-интерференция генаОбзор литературы51MtMCA8 не привела к изменению уровня клубенькообразования у линий свыключенным геном.

Это объясняется тем, что примерно 20% клетоккорневых волосков у трансгенных растений сохраняли способность кгенерации кальциевых осцилляций, а значит, были способны к восприятиюризобий, инфекции и, в конечном счете, формированию клубеньков (Capoenet al., 2011). Данное исследование показывает очевидное преимуществоиспользования мутантов, по сравнению с линиями с измененной экспрессиейгена в результате РНК-интерференции, которая не гарантирует полноговыключения экспрессии гена.До недавнего времени оставался неизвестным кальциевый канал,вовлеченный в поток кальция в нуклеоплазму. Лишь недавно было показано,что у M.

truncatula 3 гена Cyclic Nucleotide-Gated Channels (MtCNGC15a,MtCNGC15b и MtCNGC15c) кодируют кальциевые каналы, необходимые дляядерных кальциевых осцилляций (Charpentier et al., 2016). Инсерционныемутации по каждому из этих генов снижали количество инфекционных нитейи клубеньков. У мутантов Mtcngc15a, Mtcncg15b и Mtcncg15c было сниженочисло клеток, в которых генерировались кальциевые осцилляции, такжемногие клетки демонстрировали аномальный паттерн осцилляций. При этомдвойные мутанты не отличались по фенотипическому проявлению отодиночных, а тройные были нежизнеспособными, т.к. вероятно, данныекальциевые каналы функционируют во время оплодотворения.

Былопоказано, что MtCNGC15a, MtCNGC15b и MtCNGC15c локализуются вядерной оболочке (Рисунок 6). Более того, показано взаимодействиекальциевого канала MtCNGC15 c калиевым каналом MtDMI1 и иходновременное открытие (Рисунок 7) (Charpentier et al., 2016).Обзор литературы52Рисунок 7. — Модель взаимодействия CNGC15 и DMI1 в ядернойоболочкеDMI1 физически взаимодействует с CNGC15, для того, чтобыконтролировать одновременное открытие обоих каналов, посредствомпрямого связывания вторичного мессенджера с DMI1 или CNGC15 послестимуляции Nod-фактором (+NF) (Charpentier et al., 2016).Помимо описанных ранее ионных каналов важная роль в генерациикальциевых осцилляций была показана для нуклеопоринов (Downie, 2014).Так, у L. japonicus, были описаны 4 мутанта по гену Ljnup133 (Kanamori et al.,2006). Данные мутанты характеризовались температурочувствительнымфенотипом, у них не формировались клубеньки при 26 °С, при 22 °Сформировались единичные неэффективные клубеньки.

Такие клубенькихарактеризовались формированием гипертрофированных инфекционныхнитей и капель и отсутствием выхода бактерий в цитоплазму растительнойклетки. В то же время следует отметить, что в исследованных молодыхкорневых волосках мутантов отсутствовали кальциевые осцилляции, чтоуказывает на роль LjNup133 в данном процессе (Kanamori et al., 2006). Былопоказано, что LjNup133 является нуклеопорином, причем экспрессия генаLjNup133 наблюдается во всех органах растения, при этом специфическогоусиления экспрессии этого гена в корнях при инокуляции ризобиями необнаруживается, что указывает на отсутствие специфической роли LjNup133Обзор литературы53в развитии клубеньков. Также важно отметить, что значительных аномалий вразвитии мутантных растений не было выявлено, за исключением снижениясеменной продукции (Kanamori et al., 2006).У L. japonicus были описаны мутанты по генам Ljsym24, Ljsym73 иLjsym85, однако позднее было показано, что все они принадлежат одномулокусу Ljnup85 (Saito et al., 2007).

LjNup85 кодирует нуклеопорин. МутантыLjnup85–1 и Ljnup85–2 не формировали клубеньков, либо формировалиединичные клубеньки (Szczyglowski et al., 1998; Kawaguchi et al., 2002;Kistner et al., 2005), в то время как Ljnup85–3 не формировал клубеньков,представляя собой «сильную» аллель (Saito et al., 2007). При воздействииNod-факторов корневые волоски на мутантных растениях ветвились, но нескручивались, у Ljnup85–2 образовывались лишь единичные инфекционныенити.

Также у всех исследованных мутантов не наблюдалось кальциевыхосцилляций.МутантыLjnup85–2иLjnup85–3проявлялитемпературочувствительный фенотип. Было показано, что ген LjNup85экспрессируется, подобно гену LjNup133 во всех частях растения, при этомуровень экспрессии не увеличивается при инокуляции корней ризобиями.Мутации также влияют на семенную продуктивность (Saito et al., 2007).Скрининг M3 популяции растений L. japonicus, полученных послехимического мутагенеза с использованием этилметансульфоната, с цельювыявления мутантов с дефектами в развитии микоризной инфекцииобнаружил температурочувствительного мутанта Ljnena–1 (Groth et al., 2010).Данный мутант также характеризовался дефектами в развитии симбиоза сризобиями — у него не наблюдались индукция и развитие инфекционныхнитей, что сопровождалось отсутствием генерации кальциевых осцилляций.Тем не менее, на корнях мутантных растений формировались редкиеклубеньки, большинство из которых не были инфицированы. Однако вусловиях повышенного увлажнения число инфицированных клубеньковувеличивалось, было показано вовлечение в данный процесс этилена.

ОднакоОбзор литературы54инфицирование клубеньков проходило не через корневые волоски, а междуклетками коры (Groth et al., 2010), напоминая инфицирование через разрывыэпидермы,характерноедлярядабобовыхрастений,например,утропического полуводного бобового растения Sesbania rostrata Bremek. &Oberm (Goormachtig et al., 2004).

Было показано, что LjNENA являетсянуклеопорином, который совместно с LjNup85 и LjNup133 участвует вформировании ядерного порового комплекса.Примечательно, что в ходе транскриптомного анализа растений M.truncatula на ранних стадиях развития симбиоза наблюдалось значительноеусиление экспрессии генов MtNup85 и MtNup133 (Larrainzar et al., 2015).Точная функция нуклеопоринов в кальциевых осцилляциях еще невыявлена (Downie, 2014). Предполагается, что они могут быть вовлечены вселективный импорт в ядро белков, необходимых для кальциевыхосцилляций, хотя было показано, что у мутанта Ljnena–1 не нарушеналокализация одного из таких белков — LjCYCLOPS.

Также ядерныйпоровый комплекс может быть вовлечен в регуляцию пула вторичныхмессенджеров, поскольку предполагается, что кальциевые осцилляциивключаютсинхронизированныйпотоквторичныхмессенджеровизцитоплазмы в ядро (Groth et al., 2010).ВсевышеперечисленныеактивируемогодействиемкомпонентыNod-факторов,сигнальногонеобходимыдляпути,генерацииосцилляций кальция. Мутанты по кодирующим их генам блокированы настадии кальциевых осцилляций. У M. truncatula был выявлен ген MtDMI3,мутации по которому приводят к неспособности корневых волосков кскручиванию (Catoira et al., 2000), однако в отличие от мутантов по генамMtDMI1 и MtDMI2, в таких волосках активируются кальциевые осцилляции(Walker et al., 2000).

У гороха сходным фенотипом обладают мутанты по генуPsSym9 (Walker et al., 2000). Было показано, что данные гены являютсяОбзор литературыортологичнымии55кодируюткальций-икальмодулин-зависимуюпротеинкиназу (CCaMK), принадлежащую к группе серин-треонин протеинкиназ (Lévy et al., 2004). Данный белок имеет сходство с более широкойгруппой растительных белков кальций-зависимых протеин киназ (CDPK) вобласти N-концевого киназного домена, в то же время его C-концевойкальций-связывающий регуляторный домен имеет большое сходство свизинин-подобнымдоменоммлекопитающих,посколькосодержит 3кальций-связывающих мотива спираль-петля-спираль (EF-hand).

Междукиназнымикальций-связывающимидоменамилежиткальмодулин-связывающий домен (Lévy et al., 2004). Таким образом, структурныеособенности MtDMI3 предполагают, что он может распознавать кальцийнапрямую через три кальций-связывающих мотива спираль-петля-спираль,чтоиндуцируеткальмодулином,автофосфорилированиечтовсвоюочередь,иактивируетспособствуетсвязываниессубстратномуфософрилированию (Lévy et al., 2004).В отсутствии кальция CCaMK остается автоингибированной (Рисунок8). Центральным в регуляции CCaMK является домен автоингибирования,который частично совпадает с кальмодулин-связывающим доменом такимобразом, что автоингибирование супрессируется связыванием кальмодулина(Gleason et al., 2006).