Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 5

Впервыесимбиотические локусы Psym33, Psym35 и Pssym38 картированы нагенетическойкартегороха.Впервыесиспользованиемдетальнойхарактеристики фенотипических проявлений мутаций и анализа геномнойсинтении клонирован симбиотический ген гороха Pssym35, что явилосьпионерским исследованием в идентификации симбиотических генов ухозяйственно ценных бобовых растений с использованием достижений вгенетике модельных бобовых. Впервые показано существование двухгенетических подпрограмм симбиогенеза: 1) инфекции тканей клубенькаризобиями («судьбы» бактериальной клетки) и 2) органогенеза клубенька ивыявлены точки их взаимного контроля.

Впервые выявлена трехмернаяорганизация тубулинового цитоскелета в клубеньках гороха и M. truncatula исопоставленасорганизациейсимбиотическихструктурвкаждойгистологической зоне клубенька. Впервые показано, что выход бактерийявляетсянеобходимымусловиемдляреорганизациикортикальныхмикротрубочек, что сопровождает дальнейший рост инфицированныхклеток.Впервыеэндоплазматическихпоказано,чтомикротрубочекопределеннаясопровождаеторганизацияопределенныйвидоспецифичный порядок расположения симбиосом в инфицированнойклетке.

Впервые показано, что этилен необходим для развития клубеньковоймеристемы и функционирования меристемы в зрелом клубеньке. Впервыедля гороха и L. japonicus продемонстрировано, что мутации, приводящие кнеэффективным клубенькам, могут проявлять фенотип устойчивостиВведение25клубенькообразования к ингибирующему действию нитратов. Впервыепоказано, что выход ризобий в цитоплазму растительной клетки являютсянеобходимыми условиями для индукции экспрессии генов fnrN, nifA и fixN R.leguminosarum bv. viciae в процессе формирования азотфиксирующегоклубенька гороха. Впервые выявлено отсутствие репрессии симбиотическогогена R.

leguminosarum bv. viciae nodA в бактериях после выхода изинфекционных нитей, что указывает на важную функцию Nod-факторов напоздних стадиях развития клубенька. Впервые продемонстрировано, чтодифференцировка бактероидов является непрерывным процессом, онасопровождается снижением уровня экспрессии генов в азотфиксирующихбактероидах(заисключениемсимбиотическихгенов,регулируемыхкислородом), при этом способность к возращению к свободноживущемусостоянию теряется только на финальных стадиях дифференцировки.Впервые показано, что растения гороха могут воспринимать ризобии вкачестве патогенов в случае единичных мутаций в генах, контролирующихпоздние стадии развития клубенька. Впервые показано, что старениеклубенька является универсальной реакцией на неэффективность симбиоза.Впервыеполученамутациявысшегорастения,приводящаякаккповышенной устойчивости к кадмию, так и его увеличенной аккумуляции втканях растения.

Впервые показано, что единичная мутация в геноме горохаможет приводить к повышенной устойчивости к кадмию процессаформирования и функционирования симбиотических клубеньков. Впервыепоказано, что комбинация устойчивого к кадмию мутанта гороха и штаммовризобий, несущих гены гороха, кодирующих металлотионеины, может бытьперспективной для целей фиторемедиации почв, загрязненных тяжелымиметаллами.Впервыечувствительностьюкполученамутацияплотностисубстрата.горохаВпервыесповышеннойпоказано,чтотигмоморфогенетические реакции корня могут опосредоваться этиленом заВведение26счет реорганизации тубулинового цитоскелета. Впервые показано, чтоэтиленовый статус корня влияет на развитие симбиотических клубеньков.Теоретическое и практическое значениеПоказано существование двух генетических подпрограмм развитиясимбиотического клубенька: 1) инфекции тканей клубенька ризобиями(«судьбы» бактериальной клетки) и 2) органогенеза клубенька.

Разработанаметодология использования достижений генетики модельных бобовых дляклонирования симбиотических генов у важных для сельского хозяйствабобовых растений. Инициировано новое направление исследований —сравнительная клеточная биология бобовых растений. В результатепроведения исследований в данном направлении выявлены некоторыезакономерности формирования временных клеточных органелл микробногопроисхождения — симбиосом и их размещения в инфицированной клетке.Изученымолекулярно-генетическиемеханизмыстабилизациисимбиогенеза, которые являются теоретическими основами для созданиявысокоэффективных растительно-микробных взаимодействий.

Полученныетрансгенные штаммы 3841-PsMT1 и 3841-PsMT1 являются перспективнымидля использования в растительно-микробной системе, которая может бытьиспользована при создании технологий «симбиотической инженерии» дляфиторемедиациипочв,загрязненныхкадмием.Данныештаммыдепонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмовсельскохозяйственного назначения ОСХН РАН. Полученные в ходевыполенения диссертации результаты используются при чтении курсовлекцийнабиологическомфакультетеСанкт-Петербургскогогосударственного университета.Защищаемые положения диссертации:1. Множественный генетический контроль симбиогенеза включает двегенетические подпрограммы: органогенез клубенька и инфекциюВведение27тканей клубенька ризобиями.

При этом выявлены точки взаимногоконтроля реализации данных подпрограмм: 3 точки для инфекциитканей клубенька ризобиями и 1 для органогенеза клубенька.2. Модельныебобовыерастениямогутбытьиспользованыдляидентификации генов хозяйственно значимых бобовых культур, чтопродемонстрировано при клонировании гена гороха PsSym35 на основесинтении с геном L. japonicus LjNIN, первого клонированного генабобовых растений и ключевого регулятора симбиогенеза.3. Арабиногалактанпротеин-экстензины и пероксид водорода являютсянеобходимымикомпонентамиприреализациигенетическойподпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у гороха.4. Реорганизация тубулинового цитоскелета является одним из основныхмеханизмов дифференцировки клеток симбиотического клубенька приреализации генетической программы симбиогенеза.

Выход бактерий изинфекционных капель в цитоплазму растительной клетки инициируетреориентацию кортикальных микротрубочек в клубеньках гороха и M.trincatula, направленную на создание условий для увеличения размераинфицированнойсопровождаютклетки.ростЭндоплазматическиеинфекционныхнитеймикротрубочкииформированиеинфекционных капель во время развития симбиотических клубеньковгорохаиMedicagotruncatula.Различныйхарактерпаттерновэндоплазматических микротрубочек вокруг симбиосом в клубенькахгороха и M. truncatula связан с различиями в морфологии бактероидову этих видов.5. Этилен участвует в реализации генетической программы симбиогенезана различных стадиях: при росте инфекционных нитей в коре корня,формированииклубеньковоймеристемы в зрелом клубеньке.меристемыифункционированииВведение286.

Мутации в симбиотических генах как гороха, так и L. japonicus,нарушающих симбиогенез на поздних стадиях, могут одновременнонарушать нитрат-зависимую регуляцию клубенькообразования.7. Выходризобийвцитоплазмурастительнойклеткиявляетсянеобходимым условием для индукции экспрессии генов fnrN, nifA иfixN R. leguminosarum bv.

viciae при реализации генетическойподпрограммы инфекции тканей клубенька ризобиями у гороха.Отсутствие репрессии симбиотического гена R. leguminosarum bv.viciae nodA в бактериях после выхода из инфекционных нитейуказывает на важную функцию Nod-факторов для реализациигенетической программы симбиогенеза на поздних стадиях.8. Дифференцировка бактероидов является постепенным процессом, онасопровождаетсяснижениемуровняэкспрессиигеноввазотфиксирующих бактероидах (за исключением симбиотическихгенов,регулируемыхкислородом),приэтомспособностьквозращению к свободноживущему состоянию теряется на финальныхстадиях дифференцировки.9. Растение-хозяинстрогоконтролируетреализациюгенетическойпрограммы симбиогенеза не только на ранних, но и на поздних стадияхразвития симбиоза.

Мутации в единичных генах гороха могутприводить к восприятию эффективных штаммов ризобий в качествепатогенов.10.Преждевременныйзапускзавершающейстадииреализациигенетической программы симбиогенеза — старения симбиотическогоклубенька является универсальной реакцией на его неэффективность.Этилен и абсцизовая кислота являются позитивными регуляторамистарения.Введение2911. Устойчивость к кадмию как растений гороха, так их симбиотическихсистем (клубеньков) определяется общими генетическими факторами,в частности геном Pscdt.12. Трансгенныештаммы3841-PsMT1и3841-PsMT1являютсяперспективными для использования в растительно-микробной системе(кадмий-устойчивый мутант гороха SGECdt — штаммы 3841-PsMT1 и3841-PsMT1), которая может быть использована при созданиитехнологий «симбиотической инженерии» для фиторемедиации почв,загрязненных кадмием.13.Тигмоморфогенетические реакции корня у гороха, стимулируемыеплотным субстратом, опосредуются этиленом и сопровождаютсяизменениями в организации тубулинового цитоскелета.

Развитиетигмоморфогенетических реакций негативно влияет на реализациюгенетической программы симбиогенеза.Степень достоверности и апробация результатовВысокаядостоверностьиспользованиемадекватныхполученныхгенетическихрезультатовмоделей,обеспеченамногочисленнымиповторностями экспериментов, использованием современного высокоточногопрецизионногооборудования,проведениемстатистическойобработкиполученных результатов. Материалы диссертации были представлены на 60-тиотечественныхимеждународныхконференциях,втомчисле:12-мМеждународном конгрессе по азотфиксации (1999 г. Фос-ду-Игуасу, Бразилия),4-й Европейской конференции по азотфиксации (2000 г.