Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 6

Длина всех траекторий составила 10 нс. По полученнымтраекториям рассчитана зависимость величин RMSD а.о. альбумина от времени. Для всехкомплексов значение RMSD возрастало в течение первых 3 нс симуляции, затем выходилона плато и варьировало в диапазоне 0.4–0.5 нм, что указывает на стабилизациюполипептидной цепи альбумина. Исключение составил комплекс БСА со связанной всайте Tyr410 молекулой параоксона: для этого комплекса значение RMSD вышло на платопосле 8 нс симуляции.

По полученным траекториям рассчитана зависимость расстояниямежду фосфором параоксона и гидроксильным кислородом тирозинов dist(O-P) (рис.6).(б)(а)Рисунок 6. Зависимость от времени расстояния между атомом фосфора параоксона игидроксильным кислородом Тyr150(149) (а) и Tyr411(410) (б) ЧСА (светлым) и БСА(темным).Анализ полученных данных показал, что комплекс ЧСА со связанной молекулойпараоксона в сайте Tyr150 нестабилен (рис.

6а). Значение dist(O-P) первые 2 нс симуляцииколеблется в промежутке 0.4-1.0 нм, затем оставшиеся 8 нс симуляции остаетсянеизменным и колеблется незначительно на уровне 0.6 нм. Анализ положения молекулыпараоксона на этом участке траектории показал, что лиганд «зафиксирован» кулоновскимвзаимодействием между атомом фосфорильного кислорода параоксона и боковымрадикалом аминокислотного остатка Arg257.

Следует отметить, что в молекуле БСА вэтой позиции также находится остаток аргинина. Комплекс БСА с молекулой параоксонав сайте Tyr149 также нестабилен (рис. 6а). Значение dist(O-P) за первые 2 нсувеличивается до уровня 0.6 нм и остается неизменным оставшиеся 8 нс. Анализположения молекулы параоксона на этом участке траектории показал, что лиганд«зафиксирован» водородной связью между фосфорильным кислородом параоксона иатомом H2 остатка His241, а NO2 группа – кулоновским взаимодействием между атомомN лиганда и атомом O1 остатка Gln195. В молекуле ЧСА в этих позициях находятся His иGln соответственно. Как и в ЧСА, анализ аминокислотного окружения параоксона вкомплексе с БСА выявил, что в пределах 0.4 нм от атома фосфора лиганда нет ни однойаминокислоты, способной на образование ковалентной связи с молекулой параоксона.Таким образом, устойчивое положение параоксона в сайтах Tyr150 ЧСА и Tyr149БСА не совпадает, несмотря на консервативность ближайшего аминокислотногоокружения каталитического тирозина.

Графический анализ выявил, что в случае БСАаминокислоты в окружении Tyr149 расположены более компактно относительно другдруга, из-за чего стерический размер данного сайта меньше в молекуле БСА по сравнениюс ЧСА. Но и для ЧСА, и для БСА образование ковалентной связи между параоксоном иTyr150(149) невозможно в свободном немодифицированном белке. Триггером,19улучшающим сродство сайта Tyr150(149) к параоксону, может служить либо переноспротона с остатка каталитического тирозина на имидазольное кольцо соседнегоHis242(241) (Белинская и др., 2014), либо модуляция сайта эндогенными лигандами,например, жирными кислотами (Белинская и др., 2017).Зависимость расстояния между атомом фосфора параоксона и гидроксильныматомом кислорода тирозина в комплексах параоксона с Tyr411(410) от временипредставлена на рис.

6б. Динамика этой зависимости схожа для ЧСА и БСА: участки«стабильности», на которых расстояние колеблется в пределах 0.37-0.40 нм, чередуются сучастками «нестабильности», на которых молекула параоксона отдаляется откаталитического тирозина. Графический анализ показал, что на всех «стабильных»участках, как для ЧСА, так и для БСА, положение параоксона одинаково: молекулалиганда стабилизируется образованием водородной связи между группой ОН тирозина ифосфорильным атомом кислорода параоксона. Анализ зависимости расстояния междугидроксильным атомом водорода Tyr411(410) и фосфорильным атомом кислорода лигандапоказал, что периоды «стабильности» положения параоксона в сайте связываниясовпадают с периодами существования водородной связи между этими атомами. Аувеличению расстояния между параоксоном и тирозином, т.е.

уходу параоксона из сайтасвязывания, предшествует разрыв этой водородной связи. Для обоих белков существуютучастки «стабильности», на которых расстояние между атомом фосфора параоксона игидроксильным атомом кислорода каталитического тирозина достаточно близкое дляобразования ковалентной связи между лигандом и белком (Wang et al., 2009).Таким образом, сайт Tyr411(410) более консервативен: аминокислоты,принимающие участие в связывании параоксона в этом сайте (Tyr411(410), Arg410(409),Lys414(413), Arg257(256)) консервативны. И для ЧСА, и для БСА сайт Tyr411(410)является первичным сайтом фосфорилирования: для продуктивного связывания молекулыФОС не требуется дополнительных условий (связывания модуляторов в других сайтах) и,согласно данным молекулярной динамики, механизм этого процесса одинаков для обоихбелков.

Сайт Tyr150(149) менее консервативен. В связывании параоксона принимаетучастие ближайший к каталитическому тирозину аргинин, образующий водородные связис молекулой лиганда. В молекуле ЧСА это Arg222, в молекуле БСА – Arg198. Этиаргинины расположены «зеркально» относительно Tyr150(149), поэтому для жесткихмолекул или для оптически активных соединений можно ожидать различнуюэффективность связывания. И для ЧСА, и для БСА, продуктивное связывание параоксонав сайте Tyr150(149) возможно лишь после изменений в структуре альбумина (либоперенос протона с каталитического тирозина на имидазольное кольцо соседнегогистидина His242(241), либо конформационные изменения, вызванные связываниемлиганда в других сайтах). В стабильных комплексах альбумина с непродуктивносвязанным в сайте Tyr150(149) параоксоном положение боковых радикалов аминокислотсайта различно для ЧСА и БСА.

Это может быть связано с разным распределениемзарядов в молекулах этих белков: суммарный заряд молекулы ЧСА составляет -14e, а БСА-16e. Ранее было показано (Peters, 1996), что в сыворотке крови человека остатокодиночного Cys34 в 70% молекул альбумина находится в окисленном состоянии.Окисление Cys34 может влиять на распределение зарядов внутри молекулы альбумина, наконформацию Садлоу I и эффективность связывания молекул в этом сайте.20ВЫВОДЫ1) Сайт Садлоу I КСА обладает наибольшей каталитической эффективностью поотношению к п-нитрофенилацетату, которая в 2 раза выше эффективности ЧСА и в 5 раз БСА. Сродство сайта Садлоу II БСА к п-нитрофенилацетату в 2 раза выше по сравнению сКСA и ЧСA.

Ибупрофен - аллостерический ингибитор карбоксил- и арилэстеразнойактивности сайта Садлоу I, этот эффект в максимальной степени выражен у КСА и ЧСА,но на порядок меньше у БСА.2) Каталитическая эффективность сайта Садлоу I БСА по отношению к параоксону в 4раза меньше, чем по отношению к п-нитрофенилацетату; для КСА и ЧСА эти отличиясоставляют 100 и 65 раз, соответственно. Фосфорилирование сайта Садлоу II всех трехвидов альбумина при взаимодействии с параоксоном происходит быстрее ацетилированияэтих сайтов. Ибупрофен - аллостерический ингибитор фосфотриэстеразной активностисайта Садлоу I; максимальный эффект выявлен у КСА и ЧСА, но в 2 раза меньше у БСА.3) Методом остаточного ингибирования ацетилхолинэстеразы с последующимприменением формализма Скетчарда, Михаэлиса-Ментен и методов молекулярногомоделирования установлено более высокое сродство зомана к сайту Садлоу II на первойстадии взаимодействия с альбумином и лимитирующий характер второй стадиивзаимодействия, что обусловливает преимущественно транспортные функции сайтаСадлоу II при токсикологически релевантных концентрациях зомана.4) Согласно предложенной схеме (1), данные молекулярного моделированияхарактеризуют вторую стадию взаимодействия ФОС с сайтами альбумина.

По данныммолекулярного докинга, параоксон и токсические P(-) изомеры зомана лучше связываютсяс Tyr150, чем с Tyr411 ЧСА. Для продуктивного связывания зомана с Tyr411 необходимодепротонирование тирозина, при этом сродство к Tyr411 выше у нетоксичных P(+)изомеров зомана. Помимо Tyr150 и Tyr411, параоксон и токсичные изомеры зомана могутвзаимодействовать с Ser193 и Lys402 ЧСА.5) По данным сравнительного биохимического анализа in vitro и in silico, функциональныехарактеристики ЧСА и КСА отличаются между собой в меньшей степени по сравнению схарактеристиками БСА. Полученные данные подтверждают консерватизм сайта Садлоу IIпо отношению к сайту Садлоу I всех исследованных видов альбумина, а такжесвидетельствуют о консерватизме БСА по отношению к КСА и ЧСА.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИВ реферируемых журналах, рекомендованных ВАК.1.

Шмурак В. И. Определение эстеразной активности альбумина в токсикологическомэксперименте. Токсикологический Вестник. - 2011. - №2 - с.46-49.2. Шмурак В.И., Курдюков И.Д., Надеев А.Д., Войтенко Н.Г., Глашкина Л.М., ГончаровН.В. Биохимические маркеры интоксикации фосфорорганическими отравляющимивеществами. Токсикологический Вестник. - 2012. - №4 - С. 30-34.3. Прокофьева Д.С., Шмурак В.И., Садовников С.В., Гончаров Н.В.