Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 2

Болееконсервативными являются БСА по отношению к КСА и ЧСА, а также сайт Садлоу II поотношению к сайту Садлоу I всех исследованных видов альбумина.3) Эффективность фосфорилирования сайта Садлоу II всех трех видов альбумина привзаимодействии с параоксоном выше эффективности ацетилирования этого сайта привзаимодействии с п-нитрофенилацетатом.4) Исследование взаимодействия альбумина с зоманом методом остаточногоингибирования ацетилхолинэстеразы позволяет оценить аффинность к двум сайтамальбумина.5) Применение биохимических методов анализа в сочетании с методами молекулярногомоделирования позволяет определить сайты и характер взаимодействия эфирныхсубстратов с альбумином.Научная новизна.

Впервые в рамках одного исследования проведен сравнительныйанализ трех видов альбумина (БСА, ЧСА, КСА) с использованием биохимическихметодов в сочетании с методами молекулярного моделирования (молекулярный докинг имолекулярная динамика). Проведен сравнительный кинетический и ингибиторный анализначальных скоростей гидролиза НФА на двух стадиях активности (предстационарное истационарное состояния) БСА, ЧСА, КСА. Определены константы диссоциации ипроведен анализ реципрокного влияния основных сайтов альбумина при взаимодействии снегидролизуемыми лигандами (варфарин, ибупрофен).

Установлена высокаяселективность ибупрофена к сайту Садлоу II и низкая селективность варфарина к сайтуСадлоу I. Методами молекулярного моделирования впервые изучены процессывзаимодействия альбумина с НФА, параоксоном, стереоизомерами зомана,специфическими ингибиторами сайтов Садлоу I и II. Установлено, что ФОС могутпродуктивно взаимодействовать с сайтом Садлоу I альбумина; помимо Tyr150 и Tyr411ЧСА, с зоманом могут продуктивно взаимодействовать Ser193 и Lys402. При этомустановлено, что только P(-) изомеры зомана (обусловливающие его высокуютоксичность) связываются с этими сайтами на расстоянии, достаточно близком длянуклеофильной атаки кислородом (азотом) фосфора зомана.Теоретическое и практическое значение работы.

Обнаруженные сходства иразличия альбумина разных видов животных позволят точнее оцениватьэкспериментальные данные с учетом видовой специфики, что важно в свете задачтрансляционной медицины, т.к. понимание особенностей фармако- и токсикокинетикимногих соединений в организме грызунов требуется для адекватной интерпретации ихкинетических закономерностей в организме человека. Так, с НФА и параоксоном вкачестве субстрата установлено, что функциональные характеристики обоих сайтовСадлоу альбумина крысы и человека ближе между собой и существенно отличаются отхарактеристик бычьего альбумина.

Отсюда следует, что в экспериментальных моделях invitro необходимо использовать ЧСА, а не более дешевый и доступный БСА. Кроме того,учитывая наличие карбоксилэстеразы в плазме крови грызунов, в моделях in vitro и in vivo5с грызунами необходимо использовать ингибиторы карбоксилэстераз. Предложена схемаи математическая модель для описания эстеразной активности альбумина, впервыепроведен биохимический анализ функционирования двух сайтов альбумина в сочетании санализом in silico.

Результаты важны для развития методологии доклиническихисследований фармпрепаратов. Сочетание методов теоретической и экспериментальнойоценки (псевдо)эстеразной активности альбумина позволит найти способы направленноговоздействия на определенные сайты или молекулу альбумина в целом лигандамиприродного и искусственного происхождения, повышая таким образом эффективность нетолько антидотной терапии, но и терапии различных заболеваний.Апробация работы. Результаты исследований доложены на международнойпущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино,2011г.), на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализиция»(Пущино, 2011), на 11-й международной конференции по холинэстеразам (Казань, 2012),на 1-й международной научно-практической конференции «Постгеномные методыанализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010).Личный вклад.

Автор участвовал во всех экспериментах, представленных в даннойработе, проводил статистическую обработку полученных результатов, участвовал внаписании тезисов и статей, представлял результаты на конференциях. Ряд работвыполнен при участии сотрудников Института эволюционной физиологии и биохимииим.И.М.Сеченова РАН в рамках грантов РФФИ и РНФ, что нашло отражение всоответствующих публикациях.Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 148 страницахмашинописного текста, содержит 26 таблиц и 40 рисунков. Состоит из введения, обзоралитературы, описания методов исследования, 6 экспериментальных разделов собсуждением и частными выводами, заключения и общих выводов. Библиографиявключает 11 русскоязычных и 200 англоязычных источников.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫВ работе использовались реактивы: альбумины, свободные от жирных кислот(ЧСА, БСА, КСА), п-нитрофенилацетат (НФА), диэтил-4-нитрофениловый эфирфосфорной кислоты (параоксон), ДТНБ, TRIS, ацетилтиохолин (АТХ) - фирмы Sigma;фосфатный буфер (ФБ) – фирмы Биолот.Определение эстеразной активности альбумина.

Эстеразную активностьальбумина по отношению к АТХ и БТХ определяли планшетным вариантом методаЭллмана на спектрофотометрическом планшетном ридере Thermo Multiscan Ascent надлине волны 405 нм. Активность относительно НФА и параоксона определяли такжеспектрофотометрически (405 нм) по накоплению нитрофенола.Определение активности альбумина по отношению к зоману.

Проводилиэксперимент по определению скорости гидролиза зомана БСА в зависимости отконцентрации зомана в реакционной смеси. Маточный раствор зомана в концентрации 10мг/мл готовили в ацетонитриле. Рабочие растворы зомана и раствор альбумина вконцентрации 20 мг/мл готовили в ФБ в день эксперимента. Концентрации рабочихрастворов зомана были в диапазоне от 2×10-4 до 6×10-3 мг/мл.

Для учета спонтанного6гидролиза зомана для каждой концентрации зомана готовили контрольную пробу, гдераствор альбумина заменяли эквивалентным объемом ФБ. Приготовленную пробуперемешивали и помещали в термостат на 37°С. Через 60 мин каждую исследуемую иконтрольную пробу разводили в ФБ и определяли концентрацию зомана по остаточнойактивности АХЭ по методу Эллмана. В опытной пробе определяли концентрацию«свободного» зомана, в контрольной пробе определяли концентрацию «общего» зомана.Скорость гидролиза зомана альбумином рассчитывали как разницу междуконцентрациями «общего» и «свободного» зомана деленную на 60 мин.

Полученныеданные вносили в программу GraphPad Prism, трансформировали в двойные обратныекоординаты, используя модели обработки данных по Скетчарду и по Лайнуиверу-Берку.Математическая обработка данных. Данные сравнительного биохимическогоанализа предварительно обрабатывали в Microsoft Excel. Нелинейную и линейнуюаппроксимацию функций (методом наименьших квадратов), статистическую обработкуданных и визуализацию результатов выполняли с помощью языка программированияPython (http://www.python.org) в среде Jupyter с установленным ядром IPython.Использовали следующие сторонние пакеты из научного стека: NumPy, Scipy, Matplotlib,Seaborn, Pandas и LmFit (Pérez, Granger, 2007; Van Der Walt et al., 2011; Pedregosa et al.,2011; Hunter, 2007; McKinney, 2010). В тексте и таблицах приводятся данные в виде.

Планки погрешностей на рисунках соответствуют стандартной ошибке.Молекулярное моделирование. Трехмерные молекулы лигандов построены иминимизированы методом скорейшего спуска (Fletcher, Reeves, 1964) с помощьюпрограммы HyperChem 8.0 (Hypercube Inc.., 1994).

В качестве 3D модели белкаиспользованы данные рентгеноструктурного анализа молекулы альбумина человека избазы данных белковых структур (Berman et al., 2000), код структуры 2bxd (Ghuman et al.,2005). Молекулы воды и лигандов были удалены из структуры. Затем молекула альбуминабыла минимизирована методом скорейшего спуска (Fletcher, Reeves 1964) с помощьюпрограммного пакета Gromacs (Berendsen et al.,1995). Заряды на атомахдепротонированного тирозина были рассчитаны с помощью программы HyperChem 8.0(Hypercube Inc.., 1994) методом Ab Initio с использовнием базиса STO-3G (Gani et al.,2008).

Рассчитанные параметры были добавлены в библиотеки программ Autodock (Morriset al., 1998) и Gromacs (Berendsen et al., 1995), а затем использованы для процедурмолекулярного докинга и молекулярной динамики. Докинг лигандов в центры связыванияальбумина проводили с помощью программного пакета Autodock4.0 (Morris et al.,1998).Использован подход из работы (Li et al., 2008).

В исследуемом центре связывания белкастроили решетку аппроксимации размером 60 узлов в x-, y-, и z-направлении и с шагом0.0375 нм. Значение свободной энергии связывания (G) используется в программеAutodock как оценочная функция для поиска оптимальных конформаций. Энтальпийнуюсоставляющую свободной энергии рассчитывали как сумму энергий ван-дер-ваальсовых иэлектростатических взаимодействий, энергии водородных связей и десольватации.Энтропийный компонент оценивали исходя из числа «замороженных» вращающихсясвязей лиганда после связывания с белком. Константу диссоциации рассчитывали изполученного оценочного значения свободной энергии связывания: Kd=exp(G/(R*T))(Morris et al., 1998).