Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 5

Следовательно, структурных изменений данных комплексов недостаточно дляобразования продуктивного фермент-лигандного комплекса. Комплексы зомана снеактивированным сайтом Tyr150 также нестабильны. За весь период симуляции ни уодного из изомеров расстояние (O-P) не опускается ниже 0,38 нм на достаточное дляреакции время. Таким образом, для реакции гидролиза в сайте Tyr150 необходима егоактивация, т.е.

перенос протона с тирозина на гистидин. Молекулярная динамикакомплексов изомеров зомана с активированным сайтом Tyr150 показаны на рис.4а и болееподробно первые 20 пс симуляции на рис.4б. Результаты молекулярной динамикикомплексов изомеров зомана в сайте Tyr150 в состоянии протонирования 2 отличаются взависимости от вида изомера лиганда.

Комплексы альбумина с P(+) изомерами зомананестабильны, значение dist(P-O) не опускается ниже 0.38 нм на протяжении всего периодасимуляции, тогда как комплексы белка с P(-) стереоизомерами зомана стабильны напротяжении 20 пс, что является достаточным временем для стехиометрического(фосфонилирование) или каталитического взаимодейтвия с тирозином.15Рисунок 4. (а) Зависимость расстояния между гидроксильным кислородомактивированного Tyr150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана (dist_O-P) отвремени.

(б) Зависимость расстояния между гидроксильным кислородом активированногоTyr150 и атомом фосфора четырех изомеров зомана от времени (первые 20 пс симуляции).Связывание зомана в других сайтах альбумина. Ранее было показано, что 82 а.о.молекулы альбумина могут быть ацетилированы при взаимодействии с НФА (Lockridge etal., 2008). Мы проанализировали окружение этих и других аминокислот на наличиевозможных акцепторов протона, которые могли бы работать аналогично гистидину вкаталитической триаде АХЭ, принимающему протон с каталитического серина.

Послепредварительного тестирования для дальнейшей проверки были отобраны 40 сайтов,проведен докинг P(-)C(-) изомера зомана в эти сайты. Для полученных комплексов былирассчитаны Kd и расстояния между атомами фосфора зомана и карбоксильным атомомкислорода (азота в случае лизина) изучаемой аминокислоты (dist (P-O(N)). Анализ данныхпоказал, что Kd большинства комплексов очень велики (от 1010 до 23100 мкM). Лишьнесколько значений Kd комплексов близки к полученным при докинге изомеров зомана всайты Tyr150 и Tyr411 (табл.

6). Результатом молекулярного докинга зомана по сайтуSer192 является комплекс с Kd=581 мкM. Однако расстояние между атомами фосфоралиганда и кислородом гидроксильной группы серина составляет 1.1 нм. В то же время,графический анализ выявил, что молекула зомана сорбируется около сайта Ser193, арасстояние между фосфором зомана и гидроксильным кислородом Ser193 составляет0.38нм. Результатом молекулярного докинга зомана по сайту Ser193 является комплекс сKd=518 мкM. Полученная конформация совпадает с результатом докинга по Ser192.Отсутствие ковалентных аддуктов в благоприятных для этого условиях (dist(P-O)=0.38нм,Kd=518 мкM) свидетельствует о том, что Ser193 может обеспечивать истинно эстеразнуюактивность альбумина и гидролиз молекулы зомана.

Важно, что возле Ser193 находитсяостаток гистидина, а расстояние между гидроксильным кислородом серина и атомомNгистидина, способным акцептировать протон, составляет всего 0.22 нм.Таким образом, согласно данным молекулярного докинга, помимо сайтов Tyr150 иTyr411, только сайты Ser193 и Lys402 могут продуктивно взаимодействовать с зоманом.Чтобы более подробно исследовать свойства этих сайтов, был проведен докинг трехдругих стереоизомеров зомана в эти центры связывания, результаты представлены втабл.7. Как в случае Ser193, так и в случае Lys402, только P(-) изомеры зоманасвязываются с этими сайтами на достаточно близком расстоянии для нуклеофильнойатаки кислородом (азотом) фосфора зомана.16Таблица 6.

Результаты молекулярного докинга P(-)C(-) изомера зомана в возможныесайты фосфонилирования или эстеразной активности ЧСА.Ближайшая клигандуаминокислота-Расстояние доближайшейаминокислоты, нм-СайтсвязыванияKd, мкMdist (P-O(N)),нмTyr4116010.72Tyr1502800.36--Ser1925811.06Ser1930.38Ser1935180.38--Thr2432901.28Tyr1500.35Ser2872950.77Tyr1500.36Lys4027370.37--Ser4545721.14Tyr4110.71Thr5407590.87Lys4020.37АцетилированиеNPА [Lockridgeet al., 2008]++++++Табл. 7. Результат молекулярного докинга изомеров зомана в сайты Ser193 и Lys402 ЧСА.Стереоизомеры зоманаСайтПараметрысвязывания связыванияP(-)C(-)P(+)C(-)P(-)C(+)P(+)C(+)Kd, мкM518598787633Ser193dist(P-O(N)), нм 0.380.410.370.40Kd, мкM7379027631031Lys402dist(P-O(N)), нм 0.370.430.370.55Для проверки правильности расчетов и корректности используемого метода былосуществлен положительный контроль: молекулярный докинг НФА в сайты Ser193 иLys402.

Анализ полученных комплексов показал, что для Lys402 Kd=27 мкM. Расстояниемежду карбонильным углеродом лиганда и N лизина равняется 0.37 нм, что достаточнодля образования ковалентной связи. В случае Ser193, Kd полученного комплекса равна40мкM. Но графический анализ показал, что лиганд связывается на расстоянии 1.4 нм отостатка серина, так что атака серина на карбонильный углерод НФА невозможна. Анализокружения лиганда в данном комплексе показал, что НФА сорбирован в районе Ser454,который может быть ацетилирован (Lockridge et al., 2008).Сравнительный анализ in silico взаимодействия параоксона с ЧСА и БСАДокинг молекулы параоксона в сайты Tyr150(149) и Tyr411(410) ЧСА и БСА.

Длядокинга параоксона в сайт Tyr150 ЧСА использовали трехмерную модель ЧСА смолекулой варфарина в сайте Tyr150 из PDB (код структуры 4bxd), для докингапараоксона в сайт Tyr411 ЧСА – модель ЧСА с молекулой ибупрофена в сайте Tyr411 (код4bxg), а для комплексов параоксона с сайтами Tyr149 и Ty410 БСА – трехмерная модельБСА со связанной в сайте Tyr149 молекулой диэтиленгликоля и связанной в сайте Tyr410молекулой напроксена (код 4or0).

Характеристики этих комплексов приведены в табл.8.На рис.5а представлены результаты молекулярного докинга молекулы параоксона в сайтысвязывания Tyr150 ЧСА и Tyr149 БСА. Несмотря на близкие величины Kd, положениепараоксона внутри сайта связывания существенно отличается для этих белковориентацией нитрогруппы и фосфорильного атома кислорода лиганда относительно17остатка тирозина.

Анализ ближайшего аминокислотного окружения выявил, что,взаимодействуя с ЧСА, группа NO2 параоксона образует 2 водородные связи с NH2группами остатка Arg222. В молекуле БСА в этом положении находится остаток лизина,который может образовать лишь одну водородную связь. В случае с БСА группа NO2параоксона образует 2 водородные связи с NH2-группами остатка Arg198, а в молекулеЧСА в этом положении находится остаток лизина. Полученный результат согласуется сработой (Cheng, 2012), в которой показано, что разница в эффективности связыванияэргостерола с ЧСА и БСА обусловлена образованием водородной связи междуэргостеролом и Arg198.

Образование двух водородных связей усиливает прочностькомплекса лиганда с белком, обусловливая уменьшение Kd. Поэтому в энергетическинаиболее выгодных конформациях комплекса параоксона с альбумином группа NO2лиганда повернута к ближайшему остатку Arg. Различное положение аргининов в ЧСА иБСА и объясняет различие положения молекулы параоксона в сайтах связывания Tyr150ЧСА и Tyr149 БСА при близких значениях Kd.

На рисунке 5б представлены результатымолекулярного докинга молекулы параоксона в сайты связывания Tyr411 ЧСА и Tyr410БСА. Несмотря на существенное различие в оценочных значениях Kd, положениемолекулы параоксона относительно аминокислот сайта связывания одинаково для ЧСА иБСА. Сравнение энергетических составляющих показало, что вклад электростатическихвзаимодействий между белком и лигандом одинаков для обоих ферментов, разницаосуществляется за счет энергий водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий.Такое различие в этих характеристиках можно объяснить разницей в ориентации боковыхрадикалов аминокислот сайта, преимущественно положения бокового радикалаLys414(413): в случае БСА молекула параоксона находится в более близком контакте состатком лизина и образуется дополнительная водородная связь между фосфорильныматомом кислорода параоксона и аминогруппой лизина.Таблица 8.

Результат молекулярного докинга параоксона в сайты Tyr150(149) иTyr411(410) ЧСА и БСА.Сайт связыванияХарактеристикиЧСАБСАЧСА(БСА)связыванияTyr150(149)Tyr411(410)Kd, мкМ49dist(P-O), нмKd, мкМdist(P-O), нм0.36870.370.37130.35(а)(б)Рисунок 5. Результат молекулярного докинга параоксона в сайты Тyr150(149) (а) иTyr411(410) (б) ЧСА (светлым) и БСА (темным).18Молекулярная динамика комплексов альбумин-параоксон. Стабильность иконформационные изменения комплексов альбумин-параоксон были изучены методоммолекулярной динамики.