Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 3
Описание файла
Файл "Автореферат" внутри архива находится в папке "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы". PDF-файл из архива "Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
Для поиска оптимальных конформаций комплекса альбумин-лигандиспользовали ламарковский генетический алгоритм (Morris et al., 1998). Процедуру поиска7повторяли 50 раз для каждой пары белок-лиганд. Итоговые конформации комплексов,RMSD которых не превышал 0.05 нм, объединяли в кластеры и сортировали повозрастанию Kd комплекса. В итоге результатом докинга был набор из 3-6 наиболеевероятных конформаций. В каждую из этих конформаций сходится 6-18 запусковконформационного поиска.
Для описания сайтов, которые потенциально могли быотвечать за псевдоэстеразную или эстеразную активность альбумина, использоваликластер, соответствующий самой энергетически выгодной найденной конформациикомплекса сайт-лиганд. Кd рассчитывали как среднее арифметическое значений,полученных в данном кластере. Погрешность оценивали методом Корнфельда.Конформации с минимальным Kd использовали как стартовые структуры для дальнейшейсимуляции методом молекулярной динамики. Продуктивность всех отобранныхконформаций (возможность атаки каталитической аминокислоты на ФОС) оценивали порасстоянию между гидроксильным атомом кислорода (для тирозинов и серинов) или Nζатомом (для лизинов) и атомом фосфора молекулы лиганда.
Другие конформации,свободная энергия связывания которых выше (а значит и Kd больше), проверяли на«продуктивность». Конформационные изменения лиганд-ферментных комплексов вовремени рассчитывали методом молекулярной динамики с помощью программного пакетаGROMACS (Fletcher, Reeves, 1964). Комплексы, полученные методом молекулярногодокинга, виртуально помещали в периодическую кубическую решетку, заполненнуюмолекулами воды.
Длина всех траекторий составляла 1000 пс, шаг интегрирования былпринят равным 0.002 пс. Для описания молекул воды использовали модельный потенциал(Berendsen et al., 1981). Для поддержания температуры 300К и давления 1 бар применялитермостат и баростат Берендсена с временными константами 0.1 и 1 пс, соответственно(Berendsen et al., 1984; Bussi et al., 2009).
Дальние электростатические взаимодействиярассчитывали методом Эвальда (Darden et al., 1993). Взаимодействия Леннард-Джонса неучитывали при межатомном расстоянии >1 нм. Длины связей поддерживали постояннымис помощью алгоритма LINCS (Hess et al., 1997). Расчету конформационных измененийметодом молекулярной динамики предшествовала минимизация энергии системы методомскорейшего спуска (Sant’Anna et al.,2006) и релаксация системы длиной 10 пс.Ошибка метода.
Применяемый в данной работе подход (ламарковскийгенетический алгоритм) позволяет исследовать конформационное пространство лигандавнутри сайта связывания, его результатом является 50 (по заданному нами числузапусков) возможных конформаций комплекса сайт-лиганд. Конформации, разностьRMSD которых не превышает 0.05 нм, объединяются в кластер, т.е. считаются одним итем же энергетическим минимумом (можно считать, что с учетом погрешностиминимизации это одна и та же точка, в которую сходится решение). Результатом докингаявляется набор из нескольких (3-6) минимумов, т.е. из нескольких наиболее вероятныхконформаций.
В каждом из этих минимумов сходится примерно 6-18 запусковминимизации, т.е. в каждом кластере, соответствующем одному минимуму, есть 6-18близких конформаций. Указывая Kd для найденной самой выгодной конформации,использовали среднее арифметическое всех значений, полученных в данном кластере.Максимальный разброс значений в кластере составил 7% от найденного среднего.8РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕСравнительное биохимическое исследование связывающей и эстеразной активностиЧСА, БСА и КСА.Математические модели кинетики сайтов Садлоу I и II. Для анализа механизмареакций с альбумином и количественной оценки кинетических параметров применялимодель расщепления НФА альбумином (Ascenzi et al., 2015), модель расщепления НФАхимотрипсином (Bender et al., 1967), модель гидролиза НФА липазой (De Caro et al.,1986), модель ингибирования холинэстераз ФОС (Main, 1964).
На первом этапевзаимодействия альбумина с субстратом (схема 1) происходит его адсорбция в сайтеСадлоу II (ES), быстрое высвобождение продукта п-нитрофенола (P1), отмечаемое как«всплеск» активности, и необратимое ацетилирование Tyr411 (EA). На втором этапесубстрат связывается с альбумином в сайте Садлоу I, где происходит его гидролиз доацила (P2) и п-нитрофенола (P1).
В то же время, схема (1) применима для описаниявзаимодействия субстрата с каждым из двух (или более) сайтов в отдельности.(1)Схема 1. Взаимодействие между альбумином и субстратом (НФА или параоксоном). S –субстрат, P1 – п-нитрофенол, P2 – ацильная группа.Предстационарное состояние (кинетика Садлоу II). Амплитуду фазы «всплеска»,на которой происходит быстрая реакция в сайте Садлоу II, обозначим α.
Константаскорости реакции - kobs. Выход продукта представляет собой реакцию (псевдо)первогопорядка в течение почти 95% времени фазы «всплеска». Константа скоростидеацетилирования k3 по меньшей мере в 100 раз ниже константы скорости ацетилированиятирозина, полученной даже на самых низких концентрациях субстрата.Использованные нами аппроксимирующие функции имеют вид:(2)где:(3)(4)Преобразуем уравнение 4 по методу двойных обратных величин. Скоростьдеацетилирования сайта Садлоу II очень низка, поэтому константой k3 можно пренебречь:(5)Стационарное состояние (кинетика Садлоу I) описывается уравнением:(6)Уравнения 5 и 6 имеют формуи могут быть использованы длялинейного регрессионного анализа.
Определив наклон прямой и её пересечение с осьюординат, мы найдём k2, k3, Ks и.Исследование взаимодействия НФА с альбумином. Сайт Садлоу I КСА обладаетнаибольшей каталитической эффективностью по отношению к НФА, которая в 2 и 5,5 развыше по сравнению с ЧСА и БСА, соответственно (табл.1). Эти различия обусловлены9неодинаковым сродством сайта Садлоу I к субстрату, т.к.
число оборотов у ниходинаково. Различия субстратных констант КСА и ЧСА в сайте Садлоу II незначительны,тогда как у БСА величина Ks в 2 раза ниже. Это свидетельствует о консервативности сайтаСадлоу II в сравнении с сайтом Садлоу I всех исследованных видов альбумина, а такжеБСА в сравнении с КСА и ЧСА.Табл.
1. Характеристики эстеразной активности альбумина с НФА в качестве субстрата.ЧСAБСAКСAСадлоу II (предстационарный режим)-1k2 (с )0.48 ± 0.10.48 ± 0.010.47 ± 0.01Ks = k-1/k1 (мкМ)5.92 ± 0.996.28 ± 0.672.77 ± 1.1-1-1k2/Ks (мM × c )81 ± 875 ± 5173 ± 21Садлоу I (стационарный режим)-1k3 (с )0.020 ± 0.0010.020 ± 0.0030.019 ± 0.003appKm (мкМ)761.9 ± 50.52208.3 ± 73.8396.7 ± 95.1app-1-1k3/Km (мM × c )0.026 ± 0.0010.009 ± 0.0010.051 ± 0.008Исследование ингибирующего действия ибупрофена и варфарина с НФА вкачестве субстрата.
В сайте Садлоу II сродство к ибупрофену максимально у КСА, в 2раза меньше у ЧСА и в 4 раза - у БСА (табл. 2). Варфарин не влиял на Садлоу II. Выявленоаллостерическое ингибирующее влияние ибупрофена на сайт Садлоу I, максимальное (побимолекулярной константе реакции ki/Ki) для КСА, на четверть меньше для ЧСА и в 11раз - для БСА (табл. 2). Влияние варфарина максимально на Садлоу I БСА, в 3,5 разаменьше – на ЧСА и в 5,5 раз меньше – на КСА. Ингибиторный анализ такжесвидетельствует о более близких характеристиках КСА и ЧСА по сравнению с БСА.Табл.
2. Ингибирующее влияния ибупрофена и варфарина с НФА в качестве субстрата.Концентрации (мкМ): альбумин - 10, НФА – 100 мкМ, ингибиторы – 5, 10, 20, 30 мкМ.ЧСАБСAКСАСадлоу II (предстационарный режим)Ибупрофен: Ki, мкМ88.3 ± 17.68172.1 ± 28.945.9 ± 6.8Садлоу I (стационарный режим)Ибупрофен: Ki, мкМ19.9 ± 1.54.8 ± 0,62.6 ± 0.9-1ki, с0.0008 ± 0.0001 0.0010 ± 0.000010.0027 ± 0.0008-1 -1ki / Ki, мМ с0.428 ± 0.1180.050 ± 0.0120.561 ± 0.131Варфарин: Ki, мкМ73.3 ± 2.912.4 ± 0.87.0 ± 0.8-1ki, с0.0014 ± 0.00030.0005 ± 0.000040.0043 ± 0.0018-1 -1ki / Ki, мМ с0.058 ± 0.0220.036 ± 0.00230.197 ± 0.014Сравнительное исследование связывающей и эстеразной активности ЧСА, БСА иКСА с параоксоном в качестве субстрата.Сайт Садлоу I.
По отношению к параоксону наибольшей каталитическойэффективностью обладает БСA, который по показателю k3/Kmapp в 4,1 и 5,3 раза активнееКСA и ЧСA, соответственно (табл. 3). Каталитическая эффективность сайта Садлоу I БСАпо отношению к параоксону примерно в 4 раза меньше, чем по отношению к НФА; дляКСА и ЧСА эти отличия составляют 100 и 65 раз, соответственно. Функциональныехарактеристики Садлоу I КСА и ЧСА ближе между собой, что мы наблюдали также и с10НФА в качестве субстрата. Однако, по сравнению с НФА, важнейшее отличие состоит втом, что при сопоставимых значениях Km разница в скорости деацилирования составляетдесятки раз.
Относительно высокое сродство к параоксону при небольшой скоростиацилирования и деацилирования означает, что сайт Садлоу I служит исключительносредством транспортировки параоксона.Сайт Садлоу II. Как и в случае с НФА, сайт Садлоу II имеет более высокоесродство к параоксону по сравнению с Садлоу I (табл. 3). При этом аффинность Садлоу IIвсех трех видов альбумина к параоксону выше аффинности к НФА примерно в 1.5, 2.5 и 3раза для ЧСА, КСА и БСА, соответственно. Константа скорости фосфорилирования k2практически не отличается от константы скорости ацетилирования с НФА в качествесубстрата.
Расчет бимолекулярной константы реакции ингибирования (k2/Ks) даётоснования заключить, что сайт Садлоу II БСA существенно быстрее образует ковалентныесвязи с диэтилфосфатным остатком по сравнению с ЧСА и КСA (в 4 и 2,5 раза). Т.е.фосфорилирование сайта Садлоу II всех трех видов альбумина при взаимодействии спараоксоном происходит быстрее ацетилирования.Таблица 3. Кинетические характеристики активности трех видов альбумина поотношению к параоксону.ЧСАБСAКСАСадлоу II (предстационарный режим)k2 (с-1)0.43 ± 0.010.49 ± 0.020.48 ± 0.01Ks = k -1 /k 1 (мкМ)3.99 ± 1.72.41 ± 0.80.86 ± 0.1k2/Ks (мM-1 × c-1)150 ± 60230 ± 80580 ± 60-6 -1k3 (×10 с )0.82 ± 0.150.75 ± 0.210.50 ± 0.25Садлоу I (стационарный режим)k3 (×10-6 с-1)320 ± 10720 ± 70960 ± 60appKm (мкМ)801.6 ± 7.81361.6 ± 165.3447.7 ± 34.5k3/Kmapp (мМ-1 с-1)0.00040 ± 0.000010.00052 ± 0.000020.00216 ± 0.00029Влияние ингибиторов на взаимодействие альбумина с параоксоном.