Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы), страница 4

Ибупрофенингибировал фосфотриэстеразную реакцию в сайте Садлоу I (табл.4). Максимальныйэффект выявлен для ЧСА, меньше на 20% для КСА и в 2,8 раз для БСА. Посколькуибупрофен не способен напрямую взаимодействовать с сайтом Садлоу I (Ascenzi et al.,2006), очевидно, он выступает в роли аллостерического регулятора.

Определеннеконкурентный тип ингибирования ибупрофеном параоксоназной реакции в Садлоу I(рис.1). Ингибирующего влияния ибупрофена на сайт Садлоу II выявлено не было, чтообъясняется высоким сродством параоксона к данному сайту и более высокойлипофильностью ибупрофена по сравнению с параоксоном (LogP=3.6 vs 2.0).Варфарин. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии влиянияварфарина на стационарную фазу гидролиза параоксона, но в то же время незначительно инелинейно (т.е. примерно в одинаковой степени все концентрации) варфарин подавляетфазу всплеска гидролитической активности. Очевидно, медленный гидролиз параоксонаосуществляется в сайте, «неподконтрольном» варфарину, в т.ч.

в сайте Садлоу II. Крометого, как и в случае с ибупрофеном, в условиях работы с высокими концентрациями имеетзначение высокая липофильность варфарина (LogP=4). Данные ингибиторного анализа ссубстратом параоксоном подтверждают вывод о более близких функциональныххарактеристиках КСА и ЧСА по сравнению с БСА.11Рисунок 1. Неконкурентное ингибирование ибупрофеном параоксоназной активностисайта Садлоу I ЧСА: по Диксону (а), по Корниш-Боудену (б). Концентрация альбумина[E0] 375мкМ, ингибитора – 200 и 400 мкМ.Таблица 4.

Влияние ибупрофена на сайт Садлоу I различных видов альбумина прииспользовании параоксона в качестве субстратаИнгибитор / Ki, мкМЧСАБСAКСАСадлоу I (стационарный режим)686,9 ± 74,3300,4 ± 12,4Ибупрофен250,2 ± 19,9% ингибированияИсследование связывающей и эстеразной активности альбумина с зоманом вкачестве субстрата.Снижение концентрации зомана в присутствии БСА оценивали биохимическимметодом путем определения количества связавшегося с альбумином зомана поостаточному ингибированию АХЭ.

Калибровку по зоману делали в диапазонеконцентраций 1×10-8 – 1×10-7 М (рис. 2).Рисунок 2. Калибровка по зоману100в диапазоне концентрацийy = 66,336x - 91,97190R² = 0,9991×10-8 – 1×10-7 М.807060504030201001,51,71,92,12,3lg[Зоман]2,52,72,9Скорость гидролиза зомана альбумином рассчитывали по разнице концентраций«общего» и «свободного» зомана за 60 мин.

Данные вносили в программу GraphPad Prismдля обработки в моделях «грубой» линеаризации по Скетчарду и Лайнуиверу-Берку.Согласно расчету для одного сайта связывания, Bmax=231,9±6,5мкМ и Kd=46,1±6,2мкМ;для двух сайтов связывания Bmax1=37,8±5,5мкМ, Kd1=3,2±1,2мкМ, Bmax2=211,3±22,1мкМ,Kd2=90,1±12,4мкМ. По результатам применения формализма Михаэлиса-Ментен ко всемудиапазону исследуемых концентраций зомана, Km=4,1мкМ, Vmax=0,013мкМ∙мин-1. Приразделении на два диапазона концентраций (точка раздела 0,56 мкМ) показатели дляусловно «низких» концентраций: Km1=0,166мкМ, Vmax1=0,0014мкМ∙мин-1; для условно«высоких»: Km2 =46,3мкМ, Vmax2 =0,09мкМ∙мин-1.

Уточнение этих показателей возможно,12во-первых, при работе с насыщающими концентрациями зомана (а это означаетсущественное превышение – на несколько порядков - токсикологически релевантныхконцентраций), во-вторых, путем измерения скоростей образования двух продуктовреакции - фторид-иона и пинаколилметилфосфоновой кислоты – в рамках одногоэксперимента с использованием селективных ингибиторов и прецизионных химикоаналитических методов.

Трудности интерпретации и соотнесения полученных данных стем или иным сайтом обусловлены необходимостью работы с ненасыщающимиконцентрациями зомана. Мы полагаем, что показатели, свидетельствующие о болеевысоком сродстве с низкой скоростью реакции и конечной емкостью (Km1, Kd1, Vmax1,Bmax1), характеризуют сайт Садлоу II, тогда как показатели, свидетельствующие о болеенизком сродстве с высокой скоростью реакции и конечной емкостью (Km2, Kd2, Vmax2,Bmax2), характеризуют сайт Садлоу I. Подтверждение этих предположений может бытьполучено в экспериментах in silico.Поиск сайтов, ответственных за эстеразную активность альбумина, методамимолекулярного моделирования.

Анализ in silico взаимодействия зомана с ЧСА.До сих пор остается невыясненным вопрос, какие именно аминокислоты альбуминаотвечают за эстеразную и псевдоэстеразную активность. Установлено, что Tyr411образует устойчивые ковалентные аддукты преимущественно с агентами G-типа (зарин,зоман), а Tyr150 - с агентами V-типа (John et al., 2010). На основании этих данных Tyr411и Tyr150 были выбраны в качестве основных а.о. для исследования взаимодействия ЧСА сзоманом методами молекулярного моделирования. Известно, что для продуктивногосвязывания молекул субстратов и необратимых ингибиторов в активном центрехолинэстераз необходима активация аминокислот каталитической триады, в ходе которойпроисходит переход протона с гидроксила серина на имидазольное кольцокаталитического гистидина (Белинская и др., 2010).

Мы предположили, что аналогичныйперенос протона необходим и при связывании зомана с альбумином. Поэтому дляпроцедуры молекулярного докинга мы использовали два состояния процессапротонирования остатков тирозина по положениям 150 и 411: протонированное (1,неактивированное) и депротонированное (2, активированное). При анализе ближайшегоокружения Tyr411 и Tyr150 были выбраны Lys414 и His242, соответственно, в качествеакцепторов протонов. Проведен молекулярный докинг изомеров зомана в эти сайты приразличном состоянии протонирования тирозинов, стабильность полученных комплексовпроверена методом молекулярной динамики (табл.5, рис.5).Докинг зомана в сайт Tyr411 ЧСА. Анализ комплексов зомана в сайте Tyr411 припротонировании остатка тирозина показал, что значение dist(O-P) составляет 0.68 нм дляC(+) изомеров, 0.72 и 0.73 нм для P(-)C(-) и P(+)C(-) изомеров, соответственно (рис.3a).Атака гидроксила серина холинэстераз на карбонильный атом углерода лиганда возможнапри расстоянии между ними меньшем, чем 4Å (Kua et al., 2002; Zhan et al., 2002).Согласно этому критерию, полученные значения dist(O-P) слишком велики длянуклеофильной атаки Tyr411 атома фосфора зомана, образование ковалентной связимежду зоманом и Tyr411 невозможно.

Значения Kd варьируют от 578 до 859 мкM. Вкомплексах зомана в сайте Tyr411 при депротонировании остатка тирозина всестереоизомеры связываются с гидроксилом тирозина в одном и том же положении13относительно тирозина, значение dist(P-O) составляет 0.36 нм для P(+)C(+) изомера и 0.37нм для других трех изомеров (рис. 3б). В таком положении возможна атака гидроксиломтирозина атома фосфора зомана. Все изомеры связываются с одинаковойэффективностью, поскольку значения Kd варьируют от 404 до 484 мкM. Исключениесоставляет P(+)C(+) изомер, для которого Kd = 685 мкM.Таблица 5.

Оценка связывания зомана с двумя остатками тирозина ЧСА.Стереоизомеры зоманаСайт связыванияХарактеристики связыванияи его состояниеP(-)C(-)P(+)C(-)P(-)C(+) P(+)C(+)Kd (µM)578,1593,9718,9859,1нетнетнетнетГеометрия (на одной прямой?)411неактивированныйРасстояние O-P (нм)0,720,730,680,68Оценка продуктивностинетнетнетнетKd (µM)439,5483,7403,7684,6нетданетдаГеометрия (на одной прямой?)411активированный Расстояние O-P (нм)0,370,370,370,36Оценка продуктивностинетданетдаKd (µM)264,1451,0183,5431,9дадададаГеометрия (на одной прямой?)150неактивированныйРасстояние O-P (нм)0,360,330,340,34оценка продуктивностидадададаKd (µM)277,6439,4195,2431,7дадададаГеометрия (на одной прямой?)150активированный Расстояние O-P (нм)0,340,330,340,34оценка продуктивностидадададаРисунок 3. P(+)C(-) стереоизомер зомана, сорбированный в сайтах ЧСА Tyr411 (а,б)и Tyr150 (в,г) в состояниях протонирования 1 (а,в) и 2 (б,г).14Докинг зомана в сайт Tyr150 альбумина.

Анализ комплексов зомана в сайтеTyr150 при протонировании выявил, что все стереоизомеры связываются с гидроксиломтирозина в одном положении, а расстояние между гидроксильным атомом кислородатирозина и атомом фосфора зомана варьирует от 0.33 до 0.36 нм (рис. 3в). Kd для P(+)стереоизомеров выше, чем для P(-) изомеров. Эти важно, т.к. P(-) изомеры зомана болеетоксичны (Benschop et al., 1984).

C(-) и C(+) энантиомеры связываются с одинаковойэффективностью. В комплексах зомана в сайте Tyr150 в состоянии протонирования 2 всестереоизомеры также сорбируются в одинаковой позиции, значение dist(P-O) варьирует от0.33 до 0.34 нм (рис. 3г). Во всех полученных комплексах атомы кислорода тирозина,фтора и фосфора зомана лежат на одной прямой, что удовлетворяет требованиямпродуктивности.

По данным докинга, зоман с одинаковой эффективностью связывается сактивированным и неактивированным сайтом Tyr150, влияния состояния протонированиясайта Tyr150 на значения dist(P-O) и Kd не обнаружено. Все комплексы зомана с сайтомTyr150 могут считаться продуктивными. Выявлена незначительная стереоселективностьсайта Tyr411 по отношению к Р(-) стереоизомерам зомана, тогда как для сайта Tyr150 этастереоселективность ярко выражена. Однако метод докинга не учитывает такие факторыкак стерическое влияние молекул воды и подвижность белка, которые могут влиять напроцесс взаимодействия белка с лигандом.

Для выявления аллостерической модуляции вмолекуле альбумина исследовали влияние сорбции зомана в сайте Tyr150 на сорбциюзомана в сайте Tyr411.Молекулярная динамика комплексов зомана с альбумином. Время, необходимоедля образования ковалентной связи, не превышает 10 пс (Chen, 2011; Sant’Anna et al.,2006). Для проверки стабильности полученных методом докинга комплексов проведенрасчеттраекторийдвиженияатомовметодоммолекулярнойдинамики.Продолжительность симуляции (длина траекторий) составила 1000 пс. По полученнымтраекториям построена зависимость от времени расстояния dist(O-P). Анализ траекторийпоказал, что комплексы стереоизомеров зомана с Tyr411 в обоих состоянияхпротонирования нестабильны. В процессе симуляции расстояние между атомомкислорода тирозина и атомом фосфора зомана (значение dist(P-O)) не опускалось ниже0.38 нм.