Автореферат (Сравнительный анализ связывающей и эстеразной активности сывороточного альбумина человека, быка и крысы)

На правах рукописиШМУРАКВладимир ИгоревичСРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ И ЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИСЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА, БЫКА И КРЫСЫ03.01.04 - биохимияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург, 2018 г.Работа выполнена в лаборатории молекулярной токсикологии и экспериментальной терапииФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека»Федерального медико-биологического агентстваНаучный руководитель:Гончаров Николай Васильевичдоктор биологических наук,ведущий научный сотрудник НИИ гигиены, профпатологии иэкологии человека ФМБА России;зав. лабораторией Института эволюционной физиологии ибиохимии им. И.М.

Сеченова Российской академии наук.Официальные оппоненты:Орехов Александр Николаевичдоктор биологических наук, профессор,зав. лабораторией НИИ общей патологии и патофизиологии;директор НИИ атеросклероза (Сколково).Стефанов Василий Евгеньевичкандидат биологических наук, доцент,зав. кафедрой биохимии биологического факультетаСанкт-Петербургского государственного университета.Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное научноеучреждение «Институт экспериментальной медицины»Защита состоится21 июня 2018 г. в ______ на заседании Диссертационного советаД212.232.10 на базе ФГБОУ ВО СПбГУ по адресу:199034,Санкт-Петербург,Университетская наб., 7/9, ауд.

90. Тел.: (812) 328-97-41, e-mail: DSphysiol@bio.spbu.ruС диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького ФГБОУ ВОСПбГУ по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9 и на сайте СПбГУ:https://disser.spbu.ru/Автореферат разослан _____ апреля 2018 г.Ученый секретарь Диссертационного советадоктор биологических наук, профессорН.П.

АлексеевВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы. В токсикологических и фармакологическихисследованиях важно понимать специфику видовых различий экспериментальныхживотных для адекватной интерпретации полученных результатов при проведениидоклиническихиклиническихиспытаний.Применительнокизучениюфосфорорганических соединений (ФОС), одним из принципиальных особенностей кровигрызунов является наличие в ней карбоксилэстераз, тогда как в крови человека функциикарбоксилэстераз выполняет альбумин (Li et al., 2005).Альбумин - это главный белок крови млекопитающих, где его концентрациясоставляет 500-700 мкМ. Наряду с липопротеинами, альбумин является одним изважнейших биомаркеров, определяющих повышенную вероятность летального исходапациентов вне зависимости от пола, возраста и характера их заболевания (Fischer et al.,2014; Orekhov et al., 2014). Молекула альбумина не покрыта углеводной оболочкой иможет связывать самые разные молекулы и атомы: воду и катионы металлов (Са 2+, Zn2+,Cu2+, Ni2+, Cd2+, Co2+, Pt2+, Au+), свободные жирные кислоты (СЖК) и жирорастворимыегормоны, неконъюгированный билирубин, соли желчных кислот, трансферрин, окисьазота, аспирин и другие соединения (Fasano et al., 2005; Sand et al., 2015).

Связываялекарства и токсические вещества, альбумин в значительной степени определяет ихфармако- и токсикокинетику. Связывание происходит по двум первичным сайтам инескольким вторичным. Так, для СЖК имеется 7 сайтов связывания, причем связавшиесяжирные кислоты изменяют полярность и объем сайтов связывания лекарственныхпрепаратов (Ghuman et al., 2005).

Трехмерная структура альбумина сыворотки кровичеловека (ЧСA) была исследована лишь в конце ХХ в., аналогичная структура бычьегосывороточного альбумина (БСA) получена в 2012 г., а структура крысиного альбумина(КСA) не получена до сих пор. Молекула альбумина образована одной полипептиднойцепью, состоящей из 585, 584 и 583 аминокислотных остатков (а.о.) для ЧСА, КСА, БСА,соответственно (Majorek et al., 2012; Consortium, 2015; Strauss et al., 1977). Структураальбумина консервативна для всех млекопитающих: молекула состоит из трехгомологичных доменов, каждый из которых состоит из десяти спиралей и может бытьразделен на два субдомена, A и В, содержащих шесть и четыре спирали, соответственно;эти два субдомена соединены длинной петлей (Bujacz, 2012).

Молекула альбуминачеловека и быка имеет 17 дисульфидных связей и один остаток Cys со свободной SHгруппой (Bujacz, 2012; Ghuman et al., 2005). В первичной последовательности КСАстолько же остатков Cys, сколько в последовательности ЧСА и БСА, и они расположены втех же позициях (Strausberg et al. 2006), поэтому есть основания предполагать, что КСАтакже имеет 17 дисульфидных связей и одиночный Cys в своей трехмерной структуре.Выравнивание первичных последовательностей а.о. молекул ЧСA, КСA и БСA с помощьюClustal Omega (Sievers et al., 2011) показало, что наибольшей идентичностью обладаютмолекулы ЧСA и БСA – 75,6%.

Идентичность первичной структуры ЧСA и КСAсоставляет 73,0%, а БСA и КСA — 69,9%. Если же сравнить непосредственно а.о. сайтаСадлоу I (сайт Садлоу II у всех трёх видов альбумина консервативен), то здесь молекулыЧСA и КСA обладают наибольшей идентичностью – 75%, в то время как БСAдемонстрирует лишь 57% идентичности как с КСA, так и с ЧСA. Кроме того, у БСAпреобладают замены лизиновых остатков на аргининовые в сайте Садлоу I3(Lys195→Arg195, Lys199→Arg199), что сказывается на его конфигурации, посколькубоковые цепи аргинина сильнее разветвлены. Трехмерная структура альбуминадостаточно лабильна, так что при взаимодействии с молекулой альбумина разных веществимеют место такие эффекты как кооперативность и аллостерическая модуляция, обычноприсущие мультимерным белкам (Ascenzi, Fasano, 2010).

Однако, в силу вышеуказанныхразличий первичных структур, по результатам исследования функциональныххарактеристик альбумина одного вида животных нельзя a priori утверждать, что альбуминдругого вида будет обладать такими же характеристиками. Например, ЧСA привзаимодействии с жирными кислотами в растворе обладает высокой пластичностью игибкостью, тогда как характеристики БСA в растворе по отношению к жирным кислотамне сильно отличаются от расчетных данных, полученных для его кристаллическойструктуры (Reichenwallner, Hinderberger, 2013).В разные годы была показана эстеразная или псевдоэстеразная активностьальбумина по отношению к α-нафтилацетату и n-нитрофенилацетату (НФА), эфирамжирных кислот, аспирину, глюкурониду кетопрофена, циклофосфамиду, эфирамникотиновой кислоты, октаноилгрелину, о-нитроацетанилиду и т.д.

В токсикологиинаибольший интерес представляет проблема (псевдо)эстеразной активности альбумина поотношению к ФОС (эфирам фосфорной кислоты) и особенно по отношению квысокотоксичным фосфорорганическим отравляющим веществам (ФОВ) – эфирамфосфоновой кислоты, к которым относятся зарин, зоман, V-газы. Установлено два сайтаобразования ковалентных аддуктов ФОВ с ЧСА - Tyr411 и Tyr150 (Li et al., 2008; John etal., 2010). Однако, несмотря на огромные возможности современных аналитическихметодов, имеющиеся данные не позволяют однозначно решить проблему наличия илиотсутствия у альбумина эстеразной и других типов ферментативной активности.

До сихпор механизмы взаимодействия различных эфиров и других соединений с альбуминомостаются нераскрытыми, а межвидовые исследования вообще не проводились. Имеетсялишь одна работа, в которой применялись методы молекулярного моделирования дляизучения процесса взаимодействия ФОВ (зомана) с альбумином (Li et al., 2008). При этомдокинг проводили только в сайте связывания Tyr411.

Метод молекулярной динамики(McCammon et al., 1977; Стефанов и др., 2012) в этой работе не применялся.Цель настоящей работы - биохимическими методами in vitro и методамимолекулярного моделирования in silico исследовать связывающую и эстеразнуюактивность сывороточного альбумина человека (Homo sapiens), быка (Bos taurus taurus) икрысы (Rattus norvegicus).Для достижения данной цели поставлены и решены следующие задачи:1) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с п-нитрофенилацетатом;2) определить биохимическими методами in vitro кинетические и равновесныехарактеристики взаимодействия ЧСA, БСA и КСA с параоксоном;3) определить характеристики взаимодействия БСA и ЧСА с зоманом методами in vitro иin silico, установить сайты эстеразной активности альбумина;4) исследовать с помощью методов молекулярного моделирования взаимодействиепараоксона с возможными сайтами связывания ЧСA и БСA.4Положения диссертации, выносимые на защиту1) Предложена схема и математическая модель для описания каталитического истехиометрического взаимодействия альбумина с субстратами эстераз.2) Функциональные характеристики ЧСА и КСА отличаются между собой в меньшейстепени по сравнению с функциональными характеристиками БСА.