Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 16

truncatula посвящено большое количество исследований.Показано, что он отвечает за разрастание листовой пластинки, а также поменьшей мере косвенным образом участвует в ЗЭ, стимулируя разрастаниеплодолистиков при образовании женского гаметофита (Tadege et al., 2011).Повышение уровня его экспрессии в ходе СЭ говорит о его возможном участии ив этом процессе.Ген MtWOX11-like является близким гомологом генов WOX11 и WOX12 A.thaliana. Недавно было показано, что WOX11 и WOX12 участвуют в ранних этапахформирования каллуса и придаточных корней, инициируя деление клетокпрокамбия (Liu et al., 2014). Мы не выявили увеличения экспрессии генаMtWOX11-like в ходе формирования каллуса, однако наблюдали активацию этогогена в ходе СЭ, также требующего интенсивного деления клеток.Помимо этого, мы проанализировали экспрессию в тех же условияхостальных трёх генов WOX: MTR_1g115315, MTR_3g115620 и MtWOX4-like.

Мыне выявили повышения уровня экспрессии, ассоциированного с СЭ, у этих генов(Рисунок 4, г-е).87Рисунок 4. Изменение относительных уровней экспрессии генов MtWOX9-1(а), STF (б), MtWOX11-like (в), MtWOX4-like (г), MTR_1g115315 (д) иMTR_3g115620 (е) в условиях, способствующих СЭ, у эмбриогенной линии 2HA инеэмбриогенной линии A17 (0,1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель). Для генов MtWOX11-like,STF и MtWOX9-1 эксперимент проводился в трёх биологических повторностях.Для генов MtWOX4-like, MTR_1g115315 и MTR_3g115620 эксперимент проводилсявдвухбиологическихдоверительныеповторностях.интервалы,Планкирассчитанныенапогрешностейоснованииуказываютt-распределенияСтьюдента для уровня значимости 0,05.Таким образом, согласно нашим данным, из шести генов WOX и PIN с88повышенным уровнем экспрессии в семязачатках четыре активируются в ходе СЭ.В то же время, из семи генов WOX и PIN со сниженным уровнем экспрессии всемязачатках ни один не активируется в ходе СЭ.

Эти результаты позволяютпредположить, что ранние этапы соматического и зиготического эмбриогенезаконтролируются с участием одних и тех же генов WOX и PIN.3.2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ3.2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PINДля локального анализа экспрессии мы использовали растения M. truncatula,трансформированные конструкциями pSTF:GUS (Tadege et al., 2011), pMtWOX91:GUS, а также pSLM1:GUS (Zhou et al., 2011a), в которых промоторы этих геноврегулируют экспрессию репортерного гена GUS (ген β-глюкуронидазы).

Семенарастений с конструкциями pSTF:GUS и pMtWOX9-1:GUS были любезнопредоставлены доктором Миллионом Тадеге (Государственный УниверситетОклахомы, США). Семена растений с конструкцией pSLM1:GUS были любезнопредоставлены профессором Женг-Ю Вангом из Института Сэмюэля Робертса,США.Мы получили каллусы этих растений, на которых образовывалисьсоматические эмбрионы, и подвергли их GUS-окрашиванию.Анализ трансгенных растений с конструкцией pSTF:GUS. Согласнополученным нами результатам, на начальных стадиях развития каллусаактивность промотора гена STF практически отсутствовала.

Нам удалось выявитьлишь слабое окрашивание каллуса, при этом зоны окрашивания были размытыми.(Рисунок 5, а). Активацию промотора наблюдали в уже развившемся каллусе,непосредственно перед пересадкой на безгормональную среду. Зоны активациивыглядели как точки на поверхности каллуса (Рисунок 5, б).В ходе дальнейшей культивации на безгормональной среде зоны активациипромотора на поверхности каллуса становились более обширными (Рисунок 5, в).Послепоявлениясоматическихэмбрионовможнобылодетектировать89интенсивную активность промотора STF непосредственно в зародышах на стадияхглобулы и сердца; кроме того, активность промотора мы наблюдали в зонах наповерхности каллуса, находящихся рядом с соматическими эмбрионами (Рисунок5, г).

Следует также заметить, что часть соматических эмбрионов недемонстрировала наличие экспрессии репортерного гена (Рисунок 5, д).На более поздних стадиях развития каллусов зоны активации промоторастановились более чёткими и ограничивались соматическими эмбрионами,большинство которых находилось на стадии развития семядолей, а самоокрашивание было более интенсивным непосредственно в семядолях зародышей(Рисунок 5, е, ж).Таким образом, согласно данным, полученным с помощью локализацииактивности промотора, в ходе СЭ ген STF начинает экспрессироваться всформировавшемся каллусе в отдельных клетках или группах клеток наповерхности каллуса, в дальнейшем зоны его активности расширяются, а припоявлении видимых соматических эмбрионов STF экспрессируется в них самихили в ассоциированных с ними зонах.

Интенсивная активность промотора STF наконечных стадиях развития соматических эмбриона, возможно, связана с работойэтого ТФ в развитии семядолей, аналогичной его функциям при развитии листа(Tadege et al., 2011).90Рисунок5.ЭкспрессияконструкцииSTF:GUSвходеразвитияэмбриогенных каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает наэкспрессию репортерного гена GUS.

(а) Каллус на ранней стадии развития (14день культивации). (б) Развившийся каллус (40 день культивации) передпересадкой на безгормональную среду. (в) Каллус после 15 дней культивированияна безгормональной среде (48 день культивации) (г)-(ж) Каллусы с соматическими91эмбрионами (59-72 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенныесоматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которыхприсутствуетэкспрессиярепортерногогена.Белымистрелкамиуказанынеокрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы и сердца, в которыхэкспрессия репортерного гена не была детектирована.Анализ трансгенных растений с конструкцией pWOX9-1:GUS.

Аналогичныерезультаты были получены и для промотора гена MtWOX9-1: на ранних этапахразвития каллуса активность промотора была близка к нулевой (Рисунок 6, а). Вразвившемся каллусе, перед пересадкой на безгормональную среду, промоторMtWOX9-1 активировался на небольших участках на поверхности каллуса, приэтом зоны активации были более размытыми, чем в случае промотора STF(Рисунок 6, б). При появлении соматических эмбрионов мы обнаружилиактивность промотора непосредственно в зародышах на стадии глобулы, сердца исемядолей, а также в расположенных рядом зонах.

Как и в случае с геном STF, внекоторых соматических эмбрионах активность промотора MtWOX9-1 ненаблюдалась (Рисунок 6, в-ж).92Рисунок 6. Экспрессия конструкции MtWOX9-1:GUS в ходе развитияэмбриогенных каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает наэкспрессию репортерного гена GUS. (а) Каллус на ранней стадии развития (15день культивации). (б) Развившийся каллус (34 день культивации) передпересадкой на безгормональную среду. (в)-(ж) Каллусы с соматическимиэмбрионами (60-81 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенныесоматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которыхприсутствуетэкспрессиярепортерногогена.Белымистрелкамиуказанынеокрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы и сердца, в которых93экспрессия репортерного гена не была детектирована.Анализ трансгенных растений с конструкцией pSLM1:GUS.

Промотор генаSLM1 проявлял максимальную активность на этапе формирования каллуса, когдаэкспланты культивировали на среде с ауксином. В развившемся каллусе зоныэкспрессии сужались до небольших участков на поверхности, и впоследствиибыла заметна активность промотора непосредственно в соматических эмбрионах,а также в ассоциированных с ними зонах (Рисунок 7).Рисунок 7. Экспрессия конструкции pSLM1:GUS в ходе развитияэмбриогенных каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает наэкспрессию репортерного гена GUS. (а) Развившийся каллус (34 денькультивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (б) Каллус после 14дней культивирования на безгормональной среде (44 день культивации).

(в)Каллус с соматическими эмбрионами (59 день культивации). Чёрными стрелкамиуказаны окрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца исемядолей, в которых присутствует экспрессия репортерного гена.Таким образом, результаты локального анализа активности промоторов трёхисследованных генов (STENOFOLIA, MtWOX9-1 и SLM1) согласуются срезультатами анализа экспрессии с помощью ПЦР-РВ. Согласно локальномуанализу, все три гена экспрессируются в соматических эмбрионах, т.е., как мы и94предполагали, являются участниками СЭ. Интересно, что экспрессия всех этихгенов не была абсолютно специфичной для соматических эмбрионов. Если этиданные не являются следствием неточности используемого метода (например, изза неспецифичности GUS-окрашивания или недостаточной длины промотора) иотражают реальные зоны экспрессии исследуемых генов, то неспецифичностьэкспрессии может быть связана с наличием на поверхности каллуса соматическихэмбрионов на более ранних стадиях развития, которые ещё нельзя детектировать спомощью бинокуляра, но в которых уже экспрессируются перечисленные вышегены.