Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula)

Федеральное государственное бюджетное образовательноеучреждение высшего образования"Санкт-Петербургский государственный университет"Кафедра Генетики и БиотехнологииНа правах рукописиТворогова Варвара ЕвгеньевнаГены WOX и PINв регуляции соматического эмбриогенезау Medicago truncatulaСпециальность: 03.02.07 ГенетикаДиссертацияна соискание учёной степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, профессорЛутова Людмила АлексеевнаСанкт-Петербург20162ОглавлениеСписок сокращений ..................................................................................................... 4Введение .......................................................................................................................

51. Обзор литературы ................................................................................................... 101.1. Регуляция зиготического эмбриогенеза у покрытосеменных растений ........... 101.1.1. Установление апикально-базальной оси полярности ..................................... 101.1.2. Радиальная дифференцировка тканей ............................................................. 171.1.3. Спецификация апикальных меристем ............................................................. 191.1.4. Формирование билатеральной оси симметрии. Закладка семядолей ............ 211.1.5. Переход к стадии покоя.

Прорастание ............................................................ 241.2. Регуляция соматического эмбриогенеза у покрытосеменных растений .......... 261.2.1. Введение ........................................................................................................... 261.2.2. Регуляторы СЭ .................................................................................................. 301.2.3. Гормональные регуляторы СЭ .........................................................................

301.2.3.1. Ауксин, ауксиновые транспортёры PIN и их роль в СЭ .............................. 301.2.3.2. Другие фитогормоны и их роль в СЭ ........................................................... 381.2.4. Транскрипционные факторы и эффекторные белки, регулирующие СЭ ...... 401.2.4.1. ТФ WOX и их роль в СЭ ............................................................................... 431.2.5.

Эпигенетические регуляторы СЭ .................................................................... 521.3. Заключение .......................................................................................................... 552. Материалы и методы .............................................................................................. 573.

Результаты и обсуждение ....................................................................................... 783.1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматическогоэмбриогенеза .............................................................................................................. 783.1.1. Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicago truncatula взиготическом и соматическом эмбриогенезе ............................................................

783.1.2. Количественный анализ экспрессии генов WOX Medicago truncatula взиготическом и соматическом эмбриогенезе ............................................................ 843.2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ ..................................................... 883.2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN ............................ 8833.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессииисследуемых генов WOX и PIN................................................................................. 953.2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессиигена STF ...................................................................................................................... 953.2.2.2.

Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX91 ................................................................................................................................. 1073.2.2.3. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11like .............................................................................................................................

1113.2.2.4. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами STFи MtWOX9-1 и важных для СЭ ............................................................................... 1133.2.2.5. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭ ......................................................... 1164. Заключение ........................................................................................................... 1205.

Выводы.................................................................................................................. 1236. Использованная литература ................................................................................. 124Благодарности ..........................................................................................................

1504Список сокращенийСЭ – соматический эмбриогенезЗЭ – зиготический эмбриогенезТФ – транскрипционный факторНУК – нафтилуксусная кислотаБАП – бензиламинопурин2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислотаАБК – абсцизовая кислотаПАМ – побеговая апикальная меристемаКАМ – корневая апикальная меристемаPAT – полярный транспорт ауксина (Polar Auxin Transport)5ВведениеАктуальность темы исследования.Соматический эмбриогенез (СЭ) у растений – это процесс, при которомнезиготическиеклеткиформируютэмбрионы,которыепроходятчерезхарактерные стадии эмбрионального развития, в конечном счёте формируя новоерастение (Chen, 2009). Многие виды растений хранят в себе потенциальнуюспособность к СЭ, однако у большинства из них для образования соматическихэмбрионов необходимы специфические условия in vitro, которые обычновключают в себя обработку гормонами, и развитие эмбриогенного каллуса.Явление СЭ широко используется для генетической трансформациирастений, а также для получения искусственных семян (Sharma et al., 2013).

Поиски изучение регуляторов этого процесса важны для улучшения методик получениясоматических эмбрионов.Современное состояние исследованийСЭ имеет множество черт, характерных для обычного, зиготическогоэмбриогенеза (ЗЭ). В частности, в ходе развития соматического эмбриона обычноможно различить морфологические стадии, характерные для ЗЭ (Zimmerman et al.,1993).Кроме того, большинство исследованных генов, работающих в ходе ЗЭ,функционируют и при СЭ. К таким генам относятся, например, SOMATICEMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (Schmidt et al., 1997), LEAFYCOTYLEDON1 (Lotan et al., 1998), BABY BOOM1 (Boutilier et al., 2002) и другие.К числу регуляторов ЗЭ можно отнести транскрипционные факторы (ТФ) изсемейства WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX (WOX2, WOX8 и WOX9 и другие) Этифакторы определяют судьбу отдельных клеток эмбриона, которые в дальнейшемдают начало различным частям зародыша (Haecker et al., 2004).Наряду с работой ТФ, крайне важным для развития эмбриона и закладки егополярности является градиент ауксина, в создании которого принимают участие6мембранные транспортёры семейства PIN-FORMED (PIN).

На ранних этапахразвитиязиготическогоэмбрионауArabidopsisthalianaфункционируюттранспортёры ауксина PIN1, PIN4 и PIN7, локализованные на наружной мембранеклеток. Они участвуют в формировании апикально-базальной оси и в закладкесемядолей (Friml et al., 2003).Для ряда генов WOX и PIN показано их участие в процессах СЭ. Вчастности, WUSCHEL является маркером и стимулятором СЭ (Solís-Ramos et al.,2008) и участвует в закладке побеговой апикальной меристемы (ПАМ) усоматических зародышей (Chen et al., 2009, Su et al., 2015).

WOX5, в свою очередь,участвует в закладке корневой апикальной меристемы (КАМ), что было показанона A. thaliana (Su et al., 2015). На Medicago truncatula показано, что один изгомологов гена WOX9 (MtWOX9-like) также экспрессируется в соматическихзародышах (Kurdyukov et al., 2014). Исследование СЭ у винограда показало, чтопрактическивсегеныWOXуэтоговидаэкспрессируютсявходекаллусообразования и развития соматических эмбрионов (Gambino et al., 2008).Исследований роли генов семейства PIN в СЭ немного, однако к настоящемувремени уже показано участие гена PIN1 и его гомологов в процессах закладки иформирования соматических эмбрионов у A. thaliana (Su et al., 2009) и у Piceaabies (Palovaara et al., 2010).Можно предположить, что и у других видов в СЭ участвуют разные ТФWOX и транспортёры PIN, взаимодействуя друг с другом и выполняя разныефункции.

В связи с этим, мы выбрали для своих исследований гены WOX и PIN сцелью выявления остальных участников СЭ среди членов этих семейств иизучения механизмов их работы, у модельного объекта Medicago truncatula.Данный вид удобен для настоящего исследования, в первую очередь благодаряналичию генетических линий, контрастных по способностям к СЭ. В частности,были получены линии M. truncatula 2HA (Rose et al., 1999) и R-108 (Hoffmann etal., 1997), обладающие высокой эмбриогенностью в условиях in vitro, а такжелиния A17, которая практически не образует соматических эмбрионов.Целью данной работы является поиск и изучение новых регуляторов7соматического эмбриогенеза среди генов семейств WOX и PIN Medicago truncatulaДля достижения цели были сформулированы следующие задачиисследования:1.

Выявление генов семейств WOX и PIN, экспрессирующихся в ходесоматического эмбриогенеза1.1. Количественный анализ экспрессии генов семейства PIN Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе1.2 Количественный анализ экспрессии генов семейства WOX Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе2. Изучение функций исследуемых генов в соматическом эмбриогенезе2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN2.2. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений сизменённым уровнем экспрессии гена STF2.3. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений сосверхэкспрессией MtWOX9-12.4. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений спотерей функции MtWOX11-like2.5.Поискбелков,взаимодействующихсисследуемымитранскрипционными факторами WOX в процессе соматического эмбриогенезаНаучная новизна диссертационной работы.

Впервые было показаноучастие в процессах соматического эмбриогенеза генов STENOFOLIA, MtWOX9-1и SMOOTH LEAF MARGIN1, а также впервые были получены и описаны растенияMedicago truncatula с потерей функции генов MtWOX11-like и MtLEC1A. Впервыепоказано, что сверхэкспрессия генов STENOFOLIA и MtWOX9-1 увеличиваетспособность к соматическому эмбриогенезу. Впервые выявлено взаимодействиебелков MtWOX9-1 и MtLEC1A. В ходе работы впервые созданы векторныеконструкции для анализа экспрессии генов MtWOX11-like и SMOOTH LEAFMARGIN 1.Методы исследования и достоверность результатов исследования8В работе использованы разнообразные молекулярно-генетические методы(клонирование генов, трансформация дрожжей и бактерий, ПЦР, ПЦР в режимереального времени, дрожжевая двугибридная система, метод бимолекулярнойфлуоресцентной комплементации), методы визуализации экспрессии (GUSокрашивание), методы культивирования растений in vitro, компьютерный анализданных и статистические методы для оценки достоверности результатов.Исследование проводили с использованием в качестве модельного объектаMedicago truncatula.