Диссертация (1145917)
Текст из файла
Федеральное государственное бюджетное образовательноеучреждение высшего образования"Санкт-Петербургский государственный университет"Кафедра Генетики и БиотехнологииНа правах рукописиТворогова Варвара ЕвгеньевнаГены WOX и PINв регуляции соматического эмбриогенезау Medicago truncatulaСпециальность: 03.02.07 ГенетикаДиссертацияна соискание учёной степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук, профессорЛутова Людмила АлексеевнаСанкт-Петербург20162ОглавлениеСписок сокращений ..................................................................................................... 4Введение .......................................................................................................................
51. Обзор литературы ................................................................................................... 101.1. Регуляция зиготического эмбриогенеза у покрытосеменных растений ........... 101.1.1. Установление апикально-базальной оси полярности ..................................... 101.1.2. Радиальная дифференцировка тканей ............................................................. 171.1.3. Спецификация апикальных меристем ............................................................. 191.1.4. Формирование билатеральной оси симметрии. Закладка семядолей ............ 211.1.5. Переход к стадии покоя.
Прорастание ............................................................ 241.2. Регуляция соматического эмбриогенеза у покрытосеменных растений .......... 261.2.1. Введение ........................................................................................................... 261.2.2. Регуляторы СЭ .................................................................................................. 301.2.3. Гормональные регуляторы СЭ .........................................................................
301.2.3.1. Ауксин, ауксиновые транспортёры PIN и их роль в СЭ .............................. 301.2.3.2. Другие фитогормоны и их роль в СЭ ........................................................... 381.2.4. Транскрипционные факторы и эффекторные белки, регулирующие СЭ ...... 401.2.4.1. ТФ WOX и их роль в СЭ ............................................................................... 431.2.5.
Эпигенетические регуляторы СЭ .................................................................... 521.3. Заключение .......................................................................................................... 552. Материалы и методы .............................................................................................. 573.
Результаты и обсуждение ....................................................................................... 783.1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматическогоэмбриогенеза .............................................................................................................. 783.1.1. Количественный анализ экспрессии генов PIN Medicago truncatula взиготическом и соматическом эмбриогенезе ............................................................
783.1.2. Количественный анализ экспрессии генов WOX Medicago truncatula взиготическом и соматическом эмбриогенезе ............................................................ 843.2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ ..................................................... 883.2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN ............................ 8833.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессииисследуемых генов WOX и PIN................................................................................. 953.2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессиигена STF ...................................................................................................................... 953.2.2.2.
Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX91 ................................................................................................................................. 1073.2.2.3. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11like .............................................................................................................................
1113.2.2.4. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами STFи MtWOX9-1 и важных для СЭ ............................................................................... 1133.2.2.5. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭ ......................................................... 1164. Заключение ........................................................................................................... 1205.
Выводы.................................................................................................................. 1236. Использованная литература ................................................................................. 124Благодарности ..........................................................................................................
1504Список сокращенийСЭ – соматический эмбриогенезЗЭ – зиготический эмбриогенезТФ – транскрипционный факторНУК – нафтилуксусная кислотаБАП – бензиламинопурин2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислотаАБК – абсцизовая кислотаПАМ – побеговая апикальная меристемаКАМ – корневая апикальная меристемаPAT – полярный транспорт ауксина (Polar Auxin Transport)5ВведениеАктуальность темы исследования.Соматический эмбриогенез (СЭ) у растений – это процесс, при которомнезиготическиеклеткиформируютэмбрионы,которыепроходятчерезхарактерные стадии эмбрионального развития, в конечном счёте формируя новоерастение (Chen, 2009). Многие виды растений хранят в себе потенциальнуюспособность к СЭ, однако у большинства из них для образования соматическихэмбрионов необходимы специфические условия in vitro, которые обычновключают в себя обработку гормонами, и развитие эмбриогенного каллуса.Явление СЭ широко используется для генетической трансформациирастений, а также для получения искусственных семян (Sharma et al., 2013).
Поиски изучение регуляторов этого процесса важны для улучшения методик получениясоматических эмбрионов.Современное состояние исследованийСЭ имеет множество черт, характерных для обычного, зиготическогоэмбриогенеза (ЗЭ). В частности, в ходе развития соматического эмбриона обычноможно различить морфологические стадии, характерные для ЗЭ (Zimmerman et al.,1993).Кроме того, большинство исследованных генов, работающих в ходе ЗЭ,функционируют и при СЭ. К таким генам относятся, например, SOMATICEMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE (Schmidt et al., 1997), LEAFYCOTYLEDON1 (Lotan et al., 1998), BABY BOOM1 (Boutilier et al., 2002) и другие.К числу регуляторов ЗЭ можно отнести транскрипционные факторы (ТФ) изсемейства WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX (WOX2, WOX8 и WOX9 и другие) Этифакторы определяют судьбу отдельных клеток эмбриона, которые в дальнейшемдают начало различным частям зародыша (Haecker et al., 2004).Наряду с работой ТФ, крайне важным для развития эмбриона и закладки егополярности является градиент ауксина, в создании которого принимают участие6мембранные транспортёры семейства PIN-FORMED (PIN).
На ранних этапахразвитиязиготическогоэмбрионауArabidopsisthalianaфункционируюттранспортёры ауксина PIN1, PIN4 и PIN7, локализованные на наружной мембранеклеток. Они участвуют в формировании апикально-базальной оси и в закладкесемядолей (Friml et al., 2003).Для ряда генов WOX и PIN показано их участие в процессах СЭ. Вчастности, WUSCHEL является маркером и стимулятором СЭ (Solís-Ramos et al.,2008) и участвует в закладке побеговой апикальной меристемы (ПАМ) усоматических зародышей (Chen et al., 2009, Su et al., 2015).
WOX5, в свою очередь,участвует в закладке корневой апикальной меристемы (КАМ), что было показанона A. thaliana (Su et al., 2015). На Medicago truncatula показано, что один изгомологов гена WOX9 (MtWOX9-like) также экспрессируется в соматическихзародышах (Kurdyukov et al., 2014). Исследование СЭ у винограда показало, чтопрактическивсегеныWOXуэтоговидаэкспрессируютсявходекаллусообразования и развития соматических эмбрионов (Gambino et al., 2008).Исследований роли генов семейства PIN в СЭ немного, однако к настоящемувремени уже показано участие гена PIN1 и его гомологов в процессах закладки иформирования соматических эмбрионов у A. thaliana (Su et al., 2009) и у Piceaabies (Palovaara et al., 2010).Можно предположить, что и у других видов в СЭ участвуют разные ТФWOX и транспортёры PIN, взаимодействуя друг с другом и выполняя разныефункции.
В связи с этим, мы выбрали для своих исследований гены WOX и PIN сцелью выявления остальных участников СЭ среди членов этих семейств иизучения механизмов их работы, у модельного объекта Medicago truncatula.Данный вид удобен для настоящего исследования, в первую очередь благодаряналичию генетических линий, контрастных по способностям к СЭ. В частности,были получены линии M. truncatula 2HA (Rose et al., 1999) и R-108 (Hoffmann etal., 1997), обладающие высокой эмбриогенностью в условиях in vitro, а такжелиния A17, которая практически не образует соматических эмбрионов.Целью данной работы является поиск и изучение новых регуляторов7соматического эмбриогенеза среди генов семейств WOX и PIN Medicago truncatulaДля достижения цели были сформулированы следующие задачиисследования:1.
Выявление генов семейств WOX и PIN, экспрессирующихся в ходесоматического эмбриогенеза1.1. Количественный анализ экспрессии генов семейства PIN Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе1.2 Количественный анализ экспрессии генов семейства WOX Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе2. Изучение функций исследуемых генов в соматическом эмбриогенезе2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN2.2. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений сизменённым уровнем экспрессии гена STF2.3. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений сосверхэкспрессией MtWOX9-12.4. Анализ способностей к соматическому эмбриогенезу у растений спотерей функции MtWOX11-like2.5.Поискбелков,взаимодействующихсисследуемымитранскрипционными факторами WOX в процессе соматического эмбриогенезаНаучная новизна диссертационной работы.
Впервые было показаноучастие в процессах соматического эмбриогенеза генов STENOFOLIA, MtWOX9-1и SMOOTH LEAF MARGIN1, а также впервые были получены и описаны растенияMedicago truncatula с потерей функции генов MtWOX11-like и MtLEC1A. Впервыепоказано, что сверхэкспрессия генов STENOFOLIA и MtWOX9-1 увеличиваетспособность к соматическому эмбриогенезу. Впервые выявлено взаимодействиебелков MtWOX9-1 и MtLEC1A. В ходе работы впервые созданы векторныеконструкции для анализа экспрессии генов MtWOX11-like и SMOOTH LEAFMARGIN 1.Методы исследования и достоверность результатов исследования8В работе использованы разнообразные молекулярно-генетические методы(клонирование генов, трансформация дрожжей и бактерий, ПЦР, ПЦР в режимереального времени, дрожжевая двугибридная система, метод бимолекулярнойфлуоресцентной комплементации), методы визуализации экспрессии (GUSокрашивание), методы культивирования растений in vitro, компьютерный анализданных и статистические методы для оценки достоверности результатов.Исследование проводили с использованием в качестве модельного объектаMedicago truncatula.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
