Диссертация (1145917), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Достоверность экспериментальных данных, представленныхв диссертации, подтверждена воспроизводимостью результатов экспериментов идоказана с применением методов математической статистики.Основные положения, выносимые на защиту.1. Экспрессия генов MtWOX9-1, STENOFOLIA, MtWOX11-like, SMOOTHLEAF MARGIN 1 и MtLEC1A ассоциирована с процессом СЭ.2. Сверхэкспрессия STENOFOLIA и MtWOX9-1 в каллусах Medicagotruncatulaприводиткповышениюэмбриогенностиисопровождаетсяизменениями в уровнях экспрессии генов, предположительно участвующих всоматическом эмбриогенезе3.
MtWOX9-1 способен к взаимодействию с транскрипционным факторомMtLEC1A, участвующим в соматическом эмбриогенезеТеоретическая и практическая значимость работыПолученные в работе результаты позволили выявить два новых генасемейства WOX и один ген семейства PIN, участвующие в соматическомэмбриогенезе. Показано, что промоторы этих генов активны непосредственно всоматических эмбрионах, а также в ассоциированных с ними зонах, а такжепоказано влияние изменения уровня экспрессии генов MtWOX9-1 и STENOFOLIAна интенсивность соматического эмбриогенеза. Практическая значимость работыопределяется тем, что соматический эмбриогенез широко используется вбиотехнологии для трансформации и размножения растений, поэтому выявленныемеханизмы регуляции позволят улучшить имеющиеся или разработать новыепротоколы культивирования растений in vitro.9Апробация работы.Основные результаты диссертационной работыпредставлены в виде трёх статей, опубликованных в ведущих журналах,рекомендованных ВАК, а так же в виде устных и стендовых докладов наследующихконференциях:намеждународнойконференции«InternationalSymposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development» (Прага, Чехия, 2014), наIV международной школе для молодых учёных «Эмбриология, генетика ибиотехнология» (Пермь, Россия, 2012 год) и на годичном собрании обществафизиологов растений России (Санкт-Петербург, Россия, 2016).Работавыполняласьприподдержке1.15.904.2013, 1.41.801.2014, 1.42.1288.2014,грантовИАС1.15.1095.2015,101.
Обзор литературы1.1. Регуляция зиготического эмбриогенеза упокрытосеменных растенийЗиготический эмбриогенез растения — это его развитие с моментаоплодотворения и до прорастания семени. Он включает в себя такие этапы какморфогенез, т.е. закладку основных частей растения, а также созревание (рост,накопление питательных веществ и переход в стадию покоя).Из-за сходства ЗЭ и СЭ, множество гормональных и иных регуляторовфункционируют в обоих процессах.
Исходя из этого, в исследовании,посвящённом поиску новых регуляторов СЭ, нельзя не уделить внимание генам,участвующим в намного более подробно изученном процессе ЗЭ, для которыхзачастую уже хорошо известны механизмы работы.В связи с этим, в этой главе мы рассмотрим основные этапы морфогенеза исозревания зиготического зародыша, а также известные на сегодняшний деньрегуляторы этих процессов. Поскольку большинство генов, регулирующих этотпроцесс, открыты и исследованы на A. thaliana, в основном мы будем описыватьэмбриогенез именно этого модельного объекта.
Тем не менее, следует учитывать,что чёткие схемы деления клеток в ходе морфогенеза, присущие A. thaliana,свойственны далеко не всем видам цветковых растений (Lau et al., 2012).1.1.1. Установление апикально-базальной оси полярностиРаннее развитие эмбриона заключается прежде всего в закладке различныхосей полярности. Первой в эмбриогенезе возникает апикально-базальная ось:первое деление зиготы является асимметричным и приводит к образованиюменьшей апикальной и более крупной базальной клетки. Апикальная клетка вдальнейшем даёт начало почти всем органам растения. Потомки базальной клеткиформируют суспензор — нить клеток, соединяющую эмбрион с эндоспермом, атакже гипофизу — клетку, которая частично образует КАМ.
Суспензор передаётэмбриону питательные вещества и гормоны, регулирует его развитие и необходимдля правильного расположения эмбриона в зародышевом мешке. Клетки11суспензора в ходе СЭ претерпевают терминальную дифференцировку и погибаютпутём аутофагии (Smertenko, Bozhkov, 2014).Каким же образом обеспечивается асимметричное деление зиготы?У большинства цветковых растений яйцеклетка поляризована ещё дооплодотворения (ядро находится в апикальной части, ближе к микропиле, авакуоль — в базальной), однако эта полярность не сохраняется при формированиизиготы: после оплодотворения, по крайней мере у некоторых видов, зигота втечение определённого времени существует в симметричном состоянии, прикотором ядро находится в центре клетки, а в дальнейшем происходит поляризациязиготы de novo, которая и определяет её первое асимметричное деление (Ueda etal., 2011).Апикально-базальная полярность обеспечивается несколькими сигнальнымипутями.
Одним из них является путь, включающий MAPKK-киназу YODA. Длямутантов yoda характерно симметричное первое деление зиготы, так какбазальная клетка намного меньше нормы и зачастую не содержит крупнойвакуоли, как в эмбрионах дикого типа. В дальнейшем базальная клетка либо неделится, либо формирует неупорядоченную массу клеток, по строению болееблизких к клеткам собственно эмбриона, нежели к клеткам суспензора. Напротив,эктопическая активация YODA приводит к формированию более длинногосуспензора и подавлению развития самого зародыша. Таким образом, YODAдетерминирует развитие базальной части (Musielak, Bayer, 2014).Другойсигнальныйпуть,обеспечивающийапикально-базальнуюполярность - путь WRKY2-WOX.
WRKY2 принадлежит к семейству ТФ WRKY сдоменом типа «цинковые пальцы», специфичному для растений (названо попоследовательности аминокислот в ДНК-связывающем домене). В мутантах wrky2полярность яйцеклетки остаётся в норме, но поляризация зиготы de novo частонарушена, и первое деление обычно оказывается частично или полностьюсимметричным.восстанавливаютНесмотрянанормальноежизнеспособные растения.это,наразвитиестадииивсердцатакиедальнейшемэмбрионыформируют12Аномалии в раннем эмбриогенезе у мутантов wrky2 ассоциированы снарушениями экспрессии генов WOX8 и WOX9. При этом у мутантов wrky2экспрессия гена WOX8 под промотором, активным в яйцеклетке и на раннихстадиях эмбриогенеза, частично восстанавливает асимметричность делениязиготы. Эти результаты, а также анализ промоторов генов WOX8 и WOX9показали, что WRKY2 напрямую активирует экспрессию генов WOX8 и WOX9,что необходимо для формирования апикально-базальной оси зиготы (Ueda et al.,2011).Гены WOX8, WOX9, а также WOX2 являются маркерами отдельных частейзародыша на ранних стадиях развития эмбриона.
Показано, что WOX8 и WOX2коэкспрессируются в яйцеклетке и в зиготе, но после первого же деления зоны ихактивности становятся комплементарными друг другу: WOX2 экспрессируется вапикальной, а WOX8 — в базальной клетке. На стадии двух клеток вместе сWOX8 в базальной клетке активируется экспрессия гена WOX9 (Haecker et al.,2004).Апикальная клетка за счёт двух вертикальных и одного горизонтальногоделения формирует восьмиклеточный эмбрион, состоящий из апикальной ицентральной частей, а базальная клетка формирует суспензор и гипофизу. Этастадия называется стадией октанта.
Экспрессия WOX9 наблюдается в гипофизе изатем постепенно зона экспрессииперемещается в центральную часть,произошедшую из апикальной клетки. Интересно, что этого смещения непроисходит у мутантов по генам MONOPTEROS и BODENLOS, отвечающим заауксиновый сигналинг в эмбрионе. Исходя из этого, можно предположить, чтоауксин стимулирует экспрессию WOX9. Таким образом, на этой стадии WOX8экспрессируется в суспензоре и гипофизе, WOX9 – в гипофизе и в центральнойчасти, а WOX2 – в апикальной части эмбриона (Рисунок 1).13Рисунок 1.
Зоны экспрессии генов WOX в раннем ЗЭ. По Haecker et al.,2004.Какие же функции выполняют гены WOX на этих этапах эмбриогенеза?Показано, что примерно у трети мутантов с потерей функции WOX2 неправильноориентированы деления апикальной клетки. На более поздних стадиях, однако,нормальнаяморфологияэмбрионоввосстанавливается,иониобразуютфертильные взрослые растения (Haecker et al., 2004), хотя в ряде случаев умутантных эмбрионов нарушено формирование семядолей (Breuninger et al.,2008).Низкаяпенетрантностьмутацииwox2обусловлена,повидимому,избыточностью выполнения его функций в эмбриогенезе.
Потеря функциинекоторых других генов WOX (WOX1, WOX3 и WOX5) приводит к значительномуувеличению доли мутантных фенотипов. Однако, среди этих генов WOX2, повидимому,являетсяключевымрегуляторомделенийапикальнойклетки,поскольку мутации wox1, wox3 и wox5 приводят к нарушению развития14апикальной части зародыша только на фоне мутации wox2 (Breuninger et al., 2008).Двойные мутанты wox8wox9 демонстрируют нарушения развития какбазальной, так и апикальной частей зародыша, несмотря на то, что WOX8 и WOX9не экспрессируются в апикальной части. Помимо морфологических нарушений, утаких эмбрионов изменён характер экспрессии маркера апикальной частизародыша ZWILLE, а также маркера гипофизы WOX5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
