Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 20

Мы подобрали праймеры для выявлениярастений, содержащих аллель MtLEC1A со вставкой транспозона, а также длявыявления гомозиготных мутантов по MtLEC1A (см. Рисунок 15 в разделе «3.2.2.3.Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11-like»).С помощью генотипирования имеющихся у нас растений линии NF7292, мыполучили два растения, являющихся гомозиготными мутантами по гену MtLEC1A(mtlec1a). ОТ-ПЦР с кДНК, выделенной из каллусов, полученных из этихрастений, подтвердила отсутствие экспрессии MtLEC1A (Рисунок 20). Одно издвух полученных гомозиготных растений было стерильным.Рисунок 20. (а) Результаты ПЦР для проверки наличия вставки транспозонаTnt1 в MtWOX11-like в геноме растений. 1 – маркер, 2- растение линии NF7292, 3 –растение дикого типа. Наличие продукта размером около 700 н.п.

свидетельствуето присутствии вставки. (б) Результаты ПЦР для проверки гомозиготностирастений линии NF7292. 4 – маркер, 5 – растение линии NF7292, 6 –растениедикого типа. Отсутствие продукта свидетельствует об отсутствии в геномеинтактной копии MtLEC1A. (в) Результаты ОТ-ПЦР с кДНК из каллусов на срокекультивации 60 дней для проверки отсутствия экспрессии гена MtLEC1A врастениях NF7292, в геноме которых отсутствует интактная копия MtLEC1A. 7-8 каллусы дикого типа. 9-10 - каллусы mtlec1a.Интенсивность СЭ у растений с потерей функции MtLEC1A былазначительно снижена. Из 17 каллусов с потерей функции MtLEC1A, на 60 день118после начала культивации лишь 2 каллуса имели соматические эмбрионы, в товремя как из 23 каллусов растений дикого типа в этом эксперименте на такихсроках соматические эмбрионы наблюдались на 21 каллусе (Рисунок 21).Рисунок 21.

Оценка способностей к СЭ у растений с потерей функции генаMtLEC1A (а) Каллусы дикого типа (65 дней после начала культивации) (б)Каллусы mtlec1a (65 дней после начала культивации).Полученные данные позволяют предполагать наличие важной ролиMtLEC1A в СЭ, но не доказывают его. Растения из используемой нами коллекциимутантов содержат вставки транспозона Tnt1 во множестве локусов, и существуетвозможность того, что мутантный фенотип опосредован наличием вставки вкаком-либо другом месте генома. Анализ большей выборки мутантов, а такжевставка в геном мутантов функциональной копии MtLEC1A помогут подтвердитьили опровергнуть наши предположения.Близким гомологом гена MtLEC1A является ген LEC1 A. thaliana, длякоторого было показано непосредственное участие в развитии эмбриона.LEC1 является одним из немногих ТФ, которые определяют не толькоразвитие определённых органов или тканей у эмбриона, не только конкретныестадии эмбриогенеза, но и наличие эмбриональных черт в целом.

Потеря функции119LEC1 приводит к неустойчивости семян к высыханию, но, кроме этого,проявления этой мутации наблюдаются и на различных стадиях эмбриогенеза: вчастности, у таких мутантов с высокой частотой наблюдаются аномальныеделения клеток суспензора, а семядоли имеют черты строения, характерные длянормальных листьев. Также LEC1 участвует в этиоляции (Junker, Bäumlein, 2012).В то же время, сверхэкспрессия LEC1 может приводить к формированиюсоматических эмбрионов на вегетативных органах растения (Lotan et al., 1998).Эти данные, полученные нами результаты ПЦР в реальном времени (см.Рисунок 10 в разделе «3.2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений сизменённым уровнем экспрессии гена STF»), а также результаты анализа мутантовс потерей функции MtLEC1A, позволяют утверждать, что MtLEC1A являетсяучастником СЭ и, вероятно, играет важную роль в этом процессе.

Поскольку,согласно нашим данным, MtWOX9-1 также участвует в СЭ, мы предполагаем, чтовзаимодействие этих ТФ имеет значение в регуляции эмбриогенеза.1204. ЗаключениеСоматический эмбриогенез широко используется в биотехнологии и вфундаментальных исследованиях, поэтому изучение факторов, влияющих на него,и поиск стимуляторов этого процесса являются одними из ключевых задачгенетики растений.К числу регуляторов СЭ можно отнести разнообразные фитогормоны, атакже транскрипционные факторы. Ключевым фитогормоном, стимулирующимСЭ, является ауксин, и формирование градиента концентрации ауксина являетсянеобходимым фактором для начала формирования соматических эмбрионов.Градиент ауксина у растений создаётся главным образом за счёт транспортёров изсемейства PIN.

Вопрос об их функционировании в ходе СЭ остаётся малоизученным.Закладка меристем является необходимым процессом при развитиисоматических эмбрионов. Одними из важнейших регуляторов работы меристемявляются транскрипционные факторы семейства WOX. Их роль в развитиирегулярных меристем изучена достаточно подробно, однако функции генов WOX впроцессах регенерации, включающих в себя этап формирования меристем denovo, остаются слабо изученными.В нашей работе мы выявили шесть генов из семейств WOX и PIN сповышенным уровнем экспрессии в семязачатках. В дальнейшем мы показали,что уровень экспрессии четырёх из них (MtWOX9-1, STENOFOLIA, MtWOX11-likeи SMOOTH LEAF MARGIN1) повышается в ходе СЭ.

Таким образом, в нашемслучае такой способ поиска новых участников СЭ с использованием генеративныхструктур оказался весьма эффективным, несмотря на явную неточность оценки(уровень экспрессии в семязачатках сравнивали с уровнем экспрессии в целомрастении).Анализ активности промоторов генов MtWOX9-1, STENOFOLIA и SMOOTHLEAF MARGIN1 подтвердил наличие их экспрессии непосредственнов121соматических эмбрионах, а также в ассоциированных с ними зонах.

Созданныенами конструкции для анализа активности промоторов в живых каллусах in vivoпозволят детализировать характер экспрессии этих генов, а также локализоватьпереносчик ауксина SLM1 в ходе СЭ.Мы показали, что сверхэкспрессия гена STENOFOLIA стимулирует СЭ(вероятно, за счёт изменения функционирования фитогормонов в каллусе), однакоSTF не является необходимым для этого процесса: потеря функции этого гена неуменьшает, а, наоборот, немного увеличивает эмбриогенность каллуса. Потеряфункции гена MtWOX11-like также не приводит к потере эмбриогенности.Возможно, эти два гена могут замещать друг друга в ходе СЭ, поэтому возможнымследующим шагом в исследовании является анализ способностей к СЭ у растенийс потерей функции и STF, и MtWOX11-like.В то же время, сверхэкспрессия MtWOX9-1 приводит к значительномуувеличению эмбриогенности, более раннему началу формирования соматическихэмбрионов и к изменению уровня транскрипции множества генов в каллусах, чтопозволяет предполагать наличие важной роли в СЭ у этого гена.

Исследованиетранскриптома каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1, а также мутантов спотерей функции MtWOX9-1 поможет выявить механизмы работы этого гена.Поиск ТФ, взаимодействующих с исследуемыми нами белками WOX,позволил нам выявить ещё одного участника СЭ у M. truncatula - ген MtLEC1A,продукт которого взаимодействует с белком MtWOX9-1. Уровень экспрессииMtLEC1A значительно повышается в ходе СЭ, а потеря функции этого гена свысокой вероятностью приводит к сильному снижению эмбриогенности.Полученные данные в очередной раз свидетельствуют о сходстве процессовСЭ и ЗЭ, а также о сходстве способов регуляции разных типов меристем. Вчастности, известно, что гомолог MtWOX9-1 участвует в работе ПАМ (Wu et al.,2005). STENOFOLIA, другой выявленный нами участник СЭ, поддерживаетмеристематическую активность клеток листовой пластинки (Tadege et al., 2011).Ген PIN1 A.

thaliana, ближайший в геноме этого растения гомолог гена SLM1,важен для закладки примордиев листьев в ПАМ (Benková et al., 2003), а гомологи122гена MtWOX11-like стимулируют деление клеток прокамбия при закладкепридаточных корней (Liu et al., 2014).Многие вопросы, связанные с тематикой настоящей работы, остаютсянеизученными.

На наш взгляд, наиболее интересными направлениями будущихисследований являются следующие:1)Изучение распределения белков PIN, в частности, SMOOTH LEAFMARGIN1, MtPIN1 и MtPIN4 при формировании соматических эмбрионов2)Оценка способностей к СЭ у мутантов по генам MtWOX9-1 иSMOOTH LEAF MARGIN13)Поиск транскрипционных факторов, действующих вместе с MtWOX11-like и STF в ходе ходе СЭ4)Изучениебиологическогозначениявзаимодействиятранскрипционных факторов MtWOX9-1 и MtLEC1A.Полученныерезультатымогутоказатьсяполезнымикакдляфундаментальных исследований СЭ и ЗЭ, так и для разработки новыхметодов размножения растений с помощью СЭ.1235.

Выводы1. У Medicago truncatula выявлены гены семейств WOX и PIN (MtWOX9-1,STENOFOLIA, MtWOX11-like и SMOOTH LEAF MARGIN1), а также гентранскрипционного фактора MtLEC1A, экспрессия которых ассоциирована ссоматическим эмбриогенезом. Для этих генов характерен повышенный уровеньэкспрессии в генеративных органах, что подтверждает сходство процессовсоматического и зиготического эмбриогенеза.2. При изучении функций выявленных генов показано, что повышенныйуровень их экспрессии (STENOFOLIA, MtWOX9-1) в каллусах Medicago truncatulaприводит к повышению эмбриогенности и сопровождается изменениямиэкспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом гормонов и с соматическимэмбриогенезом.3. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторамисемейства WOX (WOX9, STENOFOLIA), выявил, что MtWOX9-1 способен квзаимодействию с транскрипционным фактором MtLEC1A.4.

Выявленные особенности работы генов семейств WOX и PIN в ходесоматического эмбриогенеза подтверждают гипотезу о сходстве механизмовконтроля пролиферации и дифференцировки клеток в различных типах меристем.1246. Использованная литература1.Виноградова,A.Меристематическиехарактеристикиопухолей,индуцированных Agrobacterium tumefaciens, у гороха / А. Виноградова, М.Лебедева (Осипова), Л. Лутова // Генетика. - 2015. - Т.

51, № 1. - С. 54-62.2.Abas, L. Intracellular trafficking and proteolysis of the Arabidopsis auxin-efflux facilitator PIN2 are involved in root gravitropism / L. Abas, R. Benjamins, N.Malenica, T. Paciorek, J. Wišniewska, J. Moulinier–Anzola, T. Sieberer, J. Friml, C.Luschnig // Nat Cell Biol. - 2006. - Vol. 8, № 3.