Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 17

Возможно также, что гены экспрессируются в проэмбриональных клетках,которые в дальнейшем могут образовать или не образовать соматическиеэмбрионы.Для более детального локального анализа мы создали конструкции, вкоторых под промоторами STF и MtWOX9-1 находится ген флуоресцентного белкаCherry с сигналом ядерной локализации, а также аналогичную конструкцию дляпромотора гена MtWOX11-like и флуоресцентного белка GFP.Для изучения функций гена SLM1 важна не столько локализация зоны егоэкспрессии, сколько локализация самого белка на мембране.

Поэтому нами быласоздана конструкция, включающая в себя промотор и терминатор SLM1, а такжесам ген SLM1, в который встроен ген флуоресцентного белка цитрин.Нам удалось получить трансгенные растения, содержащие только две изчетырёх перечисленных выше конструкций: мы получили 4 растения с геномфлуоресцентного белка Cherry под контролем промотора STF, и одно растение стем же геном-репортером под промотором MtWOX9-1. Трансгенность растенийбыла подтверждена с помощью ПЦР (Рисунок 8).

К настоящему моментуполучены семена этих растений, и в дальнейшем они будут использованы длялокального анализа экспрессии.95Рисунок 8. Результаты ПЦР с ДНК полученных трансформантов. 2-6 —использованы праймеры к конструкции pSTF:Cherry, ожидаемый размер продукта— 480 нп. 8-9 — использованы праймеры к конструкции pMtWOX9-1:Cherry,ожидаемый размер продукта — 611 нп. 1 — маркер, 2-5 — трансформанты сконструкцией pSTF:Cherry, 6 – растение дикого типа, 7 — маркер, 8 –трансформант с конструкцией pMtWOX9-1:Cherry, 9 — растение дикого типа.3.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённымуровнем экспрессии исследуемых генов WOX и PINДля изучения влияния исследуемых нами генов на процесс СЭ мыисследовали растения со сверхэкспрессией, а также с потерей функцииисследуемых генов.3.2.2.1.

Анализ способностей к СЭ у растений с изменённымуровнем экспрессии гена STFКоллегиизГосударственногоУниверситетаОклахомылюбезнопредоставили нам семена растений с потерей функции STF и со сверхэкспрессиейэтого гена.Мы получили каллусы растений со сверхэкспрессией STF и сравнилиинтенсивность СЭ с таковой у каллусов растений дикого типа. Былопроанализировано 34 каллуса со сверхэкспрессией STF и 35 каллусов дикого типа.Эмбрионы, видимые невооружённым глазом, выглядят как зелёныеобразования на поверхности жёлтого каллуса (Рисунок 9, а). Оценка количестваэмбрионов достаточно затруднительна, так как их может быть очень много, и они96часто сливаются друг с другом.

Для оценки мы фотографировали каллусы иоценивали долю видимой поверхности каллуса, окрашенную в зелёный, спомощью программы ImageJ. Анализ показал, что различия между каллусамидикого типа и каллусами со сверхэкспрессией, действительно, существуют(p<0,01) (Рисунок 9, б): доля поверхности каллуса, покрытая эмбрионами, длякаллусов дикого типа составляет 0,146±0,051, в то время как аналогичноезначение для каллусов со сверхэкспрессией STF составляет 0,262±0,056 (указаныдоверительные интервалы, рассчитанные с помощью t-критерия Стьюдента суровнем значимости 0,05).Рисунок 9.

(а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами.Верхнийряд—каллусыдикоготипа.Нижнийряд—каллусысосверхэкспрессией STF. (б) Средняя доля поверхности каллуса, занимаемаяэмбрионами, у каллусов дикого типа и каллусов со сверхэкспрессией STF.Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные с помощью tкритерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).Таким образом, сверхэкспрессия гена STF приводит к увеличениюинтенсивности СЭ, и, возможно, этот ТФ можно использовать в качествестимулятора этого процесса.Поскольку STF является транскрипционным фактором, вероятнее всего, онвлияет на СЭ за счёт изменения уровня экспрессии каких-либо генов-мишеней.С целью выявления причин повышенной эмбриогенности каллусов сосверхэкспрессией STF мы измерили уровни экспрессии некоторых генов в этихкаллусах и сравнили их с таковыми в каллусах дикого типа на стадии97формированиясоматическихзародышей(60днейсмоментаначалакультивирования), когда различия между двумя типами каллусов были наиболеезаметны.В первую очередь мы измерили уровни экспрессии различных генов,активация которых, согласно нашим результатам и литературным данным,ассоциирована с соматическим или зиготическим эмбриогенезом у M.

truncatula:MtSERK1, MtWOX9-1, MtWOX11-like, SMOOTH LEAF MARGIN 1 (Nolan et al.,2009, настоящее исследование). К нашему удивлению, различия в уровняхэкспрессии между каллусами различного типа обнаружить не удалось (данные непредставлены). Мы также не выявили различий в уровнях экспрессии гена MtAS2,который, как было показано, является непосредственной мишенью STF в ходеразвития листовой пластинки (Zhang et al., 2014).С целью выявления других предполагаемых мишеней гена STF в СЭ, мыпровели поиск новых участников СЭ у Medicago truncatula среди генов-гомологовизвестных участников соматического или зиготического эмбриогенеза у A.thaliana. Для анализа мы выбрали 7 генов A.

thaliana: MONOPTEROS (MP),SCARECROW (SCR), SHORT-ROOT (SHR), CUP-SHAPED COTYLEDON 2 (CUC2)(De Smet et al., 2010), LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), BABYBOOM1 (BBM1) иAGAMOUS-like 15 (AGL15) (Radoeva, Weijers, 2014). С помощью базы данныхPhytozome мы нашли гены M. truncatula, являющиеся близкими гомологамиперечисленных выше генов A. thaliana (MtMONOPTEROS, MtSCARECROW,MtSHORT-ROOT, MtCUP-SHAPED COTYLEDON 2, MtLEAFY COTYLEDON1 A,MtBABYBOOM1, MtAGAMOUS-like 15 (см. Таблицу 6). Затем с помощью ПЦР-РВмы измерили динамику их экспрессии в ходе СЭ.

Как и для генов WOX и PIN, вэтом эксперименте мы воспользовались линиями 2HA и A17, контрастными попризнаку эмбриогенности (см. раздел «3.1. Выявление генов WOX и PIN,экспрессирующихся в ходе СЭ».Для 4 из перечисленных выше 7 генов (MtMP, MtSCR, MtCUC2 и MtBBM1)мы не выявили значительного увеличения уровня экспрессии, связанного с СЭ(данные не представлены), однако три других гена (MtSHR, MtLEC1A и MtAGL15)98продемонстрировали активацию экспрессии на этапе формирования соматическихэмбрионов (Рисунок 10).Рисунок 10.

Динамика экспрессии MtSHR (а), MtAGL15 (б) и MtLEC1A (в) входе культивации эксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) инеэмбриогенной линии A17 (пунктирная линия) в условиях, способствующихпоявлению соматических зародышей. Эксперимент был проведён в двухбиологических повторностях, в них наблюдалась сходная динамика экспрессииисследуемого гена. На рисунке представлена одна серия проб, планкипогрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанные для трёханалитических повторностей.Мы сравнили уровни экспрессии выявленных предполагаемых участниковСЭ у M.

truncatula (MtSHR, MtAGL15 и MtLEC1A) в каллусах дикого типа икаллусах со сверхэкспрессией STF, однако не выявили достоверных различий.Также мы проанализировали экспрессию MtMP, MtSCR, MtCUC2 и MtBBM1,99однако и у этих генов уровни экспрессии в каллусах этих двух генотипов неразличались.Согласно более ранним исследованиям, потеря функции STF вызываетизменения в транскрипции множества гормон-ассоциированных генов (Tadege etal., 2011). Мы предположили, что причиной повышенной эмбриогенностикаллусов со сверхэкспрессией STF может являться изменение гормональногобаланса, и измерили уровни экспрессии некоторых генов, участвующих вметаболизме и сигналинге фитогормонов. В анализ были взяты 13 генов, уровеньэкспрессии которых у мутантов stf изменён по сравнению с диким типом согласнопредыдущим исследованиям (Tadege et al., 2011). Список всех генов, уровниэкспрессии которых были измерены в каллусах дикого типа и каллусах сосверхэкспрессией гена STF ( а также в каллусах с потерей функции STF - см.далее) представлен в таблице 6.Таблица 6.

Список генов, уровни экспрессии которых были измерены вкаллусах дикого типа, каллусах со сверхэкспрессией гена STF и в каллусах спотерей функции STF.Название локуса в базахОписание, предполагаемые функцииБлизкийданныхгомолог у A.Phytozome/NCBI/MtGEA/оthalianaбщепринятое название илиназвание, данное внастоящем исследованииMedtr1g097160/XM_013614Рецепторо-подобная киназа, регуляторSERK2105/Mtr.43625.1.S1_at/MtSE СЭ (Nolan et al., 2009)RK1Medtr2g015000/XM_003593Транскрипционный фактор семейства638/Mtr.5935.1.S1_at/WOX, предполагаемый участник СЭWOX9(настоящее исследование)Medtr7g086940/XM_003624Транскрипционный фактор семействаWOX11/WOX1100692/Mtr.28819.1.S1_at/MtWWOX, предполагаемый участник СЭOX11-like(настоящее исследование)Medtr7g089360/AY553212.1Транспортёр ауксина семейства PIN,2PIN1/Mtr.47942.1.S1_at/MtPIN10 предполагаемый участник СЭ/SMOOTH LEAF MARGIN(настоящее исследование)Medtr8g040900/XM_013589Транскрипционный фактор с LOB-ASYMMETRIC654/Нет в базедоменом, регулятор развития листаLEAVES 2MtGEA/MtAS2(Zhang et al., 2014)Medtr1g039040/XM_003589Транскрипционный фактор семействаLEAFY718/Нет в базеNF-YB [Nuclear Factor Y, Subunit B],COTYLEDONMtGEA/MtLEC1Aстимулятор СЭ (Lotan et al., 1998)1Medtr7g074650/XM_003623Транскрипционный фактор семействаSCARECROW651GRAS, участник зиготического/Mtr.39371.1.S1_at/MtSCRэмбриогенеза (ten Hove et al., 2015)Medtr4g097080/XM_003608Транскрипционный фактор семейства480GRAS, участник зиготического/Mtr.47195.1.S1_at/MtSHRэмбриогенеза (ten Hove et al., 2015)Medtr7g080460/XM_003624Транскрипционный фактор с AP2-164доменом, стимулятор СЭ (Boutilier et/Mtr.21627.1.S1_at/MtBBM1al., 2002)XM_013588192/Medtr0003sТФ с MADS-доменом, предполагаемый AGAMOUS-0590/Нетвбазе участник СЭ (Thakare et al., 2008)SHORTROOTBABYBOOMLIKE 15MtGEA/MtAGL15Medtr1g024025/XM_013610Транскрипционный фактор семействаARF5718/Mtr.39035.1.S1_at/MtMARF, регулятор ауксинового(MONOPTERPсигналинга (Schlereth et al., 2010)OS)Medtr2g078700/XM_013609Транскрипционный фактор семействаCUP-SHAPED196/Нет в базеNAM [No Apical Meristem], участникCOTYLEDONMtGEA/MtCUC2зиготического эмбриогенеза (Aida et2101al., 1999)Medtr7g070050/XM_003623Рецептор семейства PYR/PYL/RCAR,318/Mtr.45080.1.S1_atрегулятор сигналинга абсцизовойPYL4кислоты (Klingler et al., 2010)Medtr1g025250/BT144667Белок семейства GASA/GAST/Snakin,/Mtr.35796.1.S1_atрегулятор гиббереллиновогоGASA3сигналинга (Nahirñak et al., 2012).Medtr5g016320/XM_003611Фермент семейства GH3, участник605/Mtr.40263.1.S1_at/MtGауксинового метаболизма (Yang et al.,H3.62015)Medtr4g078710/XM_003607Транскрипционный фактор с AP2-448/Mtr.26158.1.S1_atдоменом, регулятор этиленовогоGH3.1ERF9сигналинга (Licausi et al., 2013)Medtr2g014300/XM_003593Транскрипционный фактор с AP2-578/Mtr.985.1.S1_atдоменом, регулятор этиленовогоERF12сигналинга (Licausi et al., 2013)Medtr8g026960/XM_003627Транскрипционный фактор семейства463/Mtr.18769.1.S1_at/MtHHD-Zip I, регулятор сигналингаB1,абсцизовой кислоты (Ariel et al., 2010)Medtr1g019410/XM_003589Гидроксилаза абсцизовой кислоты135/Mtr.24418.1.S1_atсемейства Cytochrome P450, участникATHB12CYP707A4метаболизма абсцизовой кислоты(Kushiro et al., 2004)Medtr1g082290/XM_003591Гистидиновая киназа, участник002/Mtr.11553.1.S1_atцитокининового сигналинга (HutchisonAHP1et al., 2006)Medtr4g086130/XM_003607Гидроксилаза абсцизовой кислоты927/Mtr.42075.1.S1_atсемейства Cytochrome P450 (Kushiro etal., 2004)CYP707A4102Medtr3g084250/XM_003601Ауксин-чувствительный белок629/Mtr.14486.1.S1_atсемейства SAUR (Ren, Gray, 2015)Medtr4g072890/Нет номераАуксин-чувствительный белокAT4G38840AT5G18080в базе NCBI/Mtr.697.1.S1_at семейства SAUR (Ren, Gray, 2015)Medtr4g072230/XM_003607Ауксин-чувствительный белок051/Mtr.49767.1.S1_x_atсемейства SAUR (Ren, Gray, 2015)Medtr8g076040/XM_003629Ауксин-чувствительный белок290/Mtr.49400.1.S1_atсемейства SAUR (Ren, Gray, 2015)AT4G38840AT4G34760В большинстве случаев никакой разницы в уровнях экспрессии выявлено небыло (данные не представлены).