Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 12

Для дрожжевойдвугибридной системы использовали штамм Saccharomyces cerevisiae Y2H Gold58(Clontech),любезнопредоставленныйколлегамиизГосударственногоУниверситета Оклахомы (США).Условия выращивания растений. Растения M. truncatula и Nicotianabenthamiana выращивали в условиях in vitro и in vivo при температуре 21º-23º С(для M.

truncatula) и 26º-28º С (для N.benthamiana), с продолжительностью дня иночи 16 и 8 часов, с освещённостью 2500 люкс и относительной влажностью 75%.Для получения асептических растений семена M. truncatula обрабатываликонцентрированной серной кислотой (95-97%) в течение 10 минут, затемпромывали 10 раз водопроводной водой. После этого семена обрабатывалираствором гипохлорита натрия (отбеливатель «Белизна») в течение 8 минут ипромывали 10 раз стерильной дистиллированной водой.

Простерилизованныетаким образом семена проращивали на агаре (1%). Затем проросшие семенапересаживали на модифицированную среду Fahraeus (Fahraeus, 1957).Для получения соматических эмбрионов у линии 2HA использовалиследующий протокол культивирования: у асептических растений возрастом до 30дней срезали листья. У каждого листочка сложного листа обрезали кромку,формируяпрямоугольныйэксплант.Полученныйэксплантпомещалиабаксиальной стороной вверх на среду P4 (10:4) (Chen, 2009), содержащую 10мкM НУК и 4 мкM БАП, и культивировали на этой среде в течение трёх недель (вэто время формировались каллусы). Затем полученные каллусы пересаживали насреду P4 (0), по составу солей и витаминов идентичную P4 (10:4), но несодержащую растительных гормонов, и культивировали в течение ещё трёхнедель.

В аналогичные условия помещали экспланты растений линии A17.Получение соматических эмбрионов у растений линии R-108 проводили согласнопротоколу Hoffman с соавторами (Hoffmann et al., 1997). У асептических растенийвозрастом до 30 дней срезали листья, отрезали отдельные простые листочки отсложного листа, наносили несколько надрезов на абаксиальной стороне иполученный эксплант помещали абаксиальной стороной вверх на среду длякультивирования.Такжевкачествеисточникаэксплантовиспользовалифрагменты черешков листьев длиной 5-8 мм, на которые наносили несколько59надрезов.

В качестве среды для культивирования использовали среду SH (см.Таблицу 1), содержащую 18 мкМ 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д),2.22 мкМ БАП и агар в качестве желирующего агента.Таблица 1. Состав среды SHКомпонентКоличество на 1 л.MgSO4.7 H2O0,185 гKNO32,83 г(NH4)2SO40,463 гCaCl2*2 H2O0,166 гKH2PO40,400 гMnSO4. H2O1 мгH3BO30,5 мгZnSO4.7 H2O0,1 мгKI0,1 мгNa2MoO4.2 H2O0,01 мгCuSO4.5 H2O0,02 мгНикотиновая кислота0,5 мгТиамина гидрохлорид0,5 мгПиридоксина гидрохлорид0,5 мгМезоинозит100 мгХелат железа (ЭДТА)0,1 мМСахарозаАгар/фитагельpH (подводить KOH и HCl20 г12 г / 5 г5,8На данной среде экспланты культивировали 30-40 дней, производяпересадку на свежую среду каждые 10 дней.

В это время формировались каллусы.60Полученные каллусы пересаживали на среду, идентичную описанной выше средеSH, но не содержащую растительных гормонов, и культивировали в течение ещё30-40 дней, производя пересадку на свежую среду каждые 10 дней. Затемпроизводили оценку образовавшихся каллусов.Трансформацию растений проводили согласно следующему протоколу.Растения M. truncatula линии R-108 выращивали в грунте в течение 4-6недель. Перед началом трансформации клетки A. tumefaciens (штамм AGL1) снеобходимой плазмидой рассевали на чашку с твёрдой средой YEP снеобходимыми антибиотиками и выращивали в течение 2 суток при температуре30оС.

Одну колонию высевали в 5 мл жидкой среды YEP с необходимымиантибиотиками и инкубировали при 30оС на шейкере (200 об/мин) в течение ночи.Утром 2 мл ночной культуры добавляли к 30 мл жидкой среды YEP снеобходимыми антибиотиками и инкубировали несколько часов до оптическойплотности OD600=0,5-1,0. Затем культуру осаждали и ресуспендировали в средедля трансформации (0,5X среда SH с 18 мкМ 2,4-Д, 2.22 мкМ БАП и 100 мг/лацетосирингона, без добавления агара).Перед началом трансформации листья и черешки растений M. truncatulaсобирали в 50 мл фальконы с дистиллированной водой.

Затем воду сливали, алистья промывали в 70% этаноле в течение 1 минуты. Этанол сливали идобавляли 5% раствор отбеливателя «Белизна» с добавлением 1-2 капель Tween20. Листья инкубировали в стерилизующем растворе в течение 10 минут примедленном покачивании, затем промывали 5-7 раз стерильной водой. После этогоот сложных листьев отрезали по листочку, с помощью скальпеля наносилинесколько надрезов с абаксильной стороны листа или несколько надрезов начерешке и погружали в суспензию агробактерий в среде для трансформации.Листья в суспензии инкубировали в течение 15 минут при медленномпокачивании, затем суспензию бактерий сливали, а листья переносили на твёрдуюсреду SH для кокультивации (среда SH с 18 мкМ 2,4-Д и 2.22 мкМ БАП.Желирующий агент - фитагель) и инкубировали при 23оС в темноте в течениепримерно 40 часов.

Затем листовые экспланты пересаживали на твёрдую среду SH61для каллусообразования (среда SH с 18 мкМ 2,4-Д, 2.22 мкМ БАП и сдобавлением селективного агента для отбора трансгенных клеток растений, атакже цефотаксима (250 мг/л) для удаления агробактерий. Желирующим агентомявляется фитагель). На данной среде листовые экспланты культивировали втечение 4-6 недель до образования каллуса.

Каждые 10 дней эксплантыпересаживали на свежую среду SH для каллусообразования. Полученные каллусыпересаживали на среду SH для регенерации (среда SH с 2.22 мкМ БАП и сдобавлением селективного агента для отбора трансгенных клеток растений(концентрация снижена в 2 раза по сравнению со средой для каллусообразования),а также цефотаксима (250 мг/л) для удаления агробактерий. Желирующим агентомявляется агар). На данной среде каллусы культивировали в течение 2-3 месяцев доформирования проростков. Когда каллусы становились зелёными, концентрациюБАП в среде снижали в 2 раза, затем в 4 и, наконец, переставали добавлять БАП.После появления проростков их пересаживали на среду для корнеобразования(0,5X среда SH.

Желирующим агентом является агар). Развившиеся проросткиразмером около 1-2 см пересаживали в грунт и выращивали до появления семян.Растения in vivo выращивали в вермикулите, который поливали раз в двенедели раствором солей Fahraeus (см.

выше), или в универсальном питательномгрунте Terra Vita (Фарт, Россия).Условия выращивания микроорганизмов. Для выращивания бактерийЕ.coli использовали твёрдую или жидкую среду LB (на 1 л дистиллированнойводы: 10 г NaCl, 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г агара (в случаетвёрдой среды)). Культуры выращивали в термостате или на качалке при 37ºС.ДлявыращиваниябактерийAgrobacteriumtumefaciensиспользовалитвёрдую или жидкую среду YEP (на 1 л дистиллированной воды: 5 г NaCl, 10 гтриптона, 10 г дрожжевого экстракта, 15 г агара (в случае твёрдой среды)).Для выращивания Sacсharomyces cerevisiae использовали твёрдую илижидкую среду YPAD (на 1 л дистиллированной воды: 10 г дрожжевого экстракта,20 г пептона, 20 г глюкозы 100 мг аденингемисульфата, 20 г агара (для твёрдойсреды), pH - 6,0).62Молекулярно-биологические методы.

Тотальную РНК из взрослыхрастений и тотальную РНК из семязачатков M. truncatula выделяли с помощьюкита RNeasy Micro Kit (Quiagen, Германия) в соответствии с инструкциямипроизводителя. РНК из растительных эксплантов и каллусов выделяли с помощьюреагента Purezol (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя.Очистку РНК от примесей геномной ДНК проводили с помощью ферментаДНКазы I (Thermo Scientific, США). Для обратной транскрипции брали в разныхэкспериментах от 70 до 1000 нг РНК. Обратную транскрипцию РНК проводили спомощью обратной транскриптазы RevertAid (Thermo Scientific, США) c праймераoligo-dT18, в соответствии с инструкциями производителя.

Полученные пробыкДНК разводили стерильной водой до конечного объема 100 мкл.Для ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) использовали набор реагентов дляпроведения ПЦР-РВ в присутствии красителя Eva Green (Синтол, Россия). ПЦРРВ проводили на амплификаторе CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad).

Расчеты пороговых циклов (Ct) проводили с помощью программы CFXManager (Bio-Rad). Количественную оценку экспрессии анализируемого генапроводили по методу 2-ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001). В качестве референсныхгенов использовали гены убиквитина (XM_003627103/MTR_8g018230) или актина(XM_003602497/MTR_3g095530).Данныепредставленывотносительныхединицах, рассчитанных относительно уровня экспрессии гена в образцекалибраторе.Выделение ДНК из растений для клонирования осуществляли с помощьюметода с использованием буфера, содержащего цетилтриметиламмонийбромид(ЦТАБ) (Murray, Thompson, 1980). Для этого ткани растений растирали в жидкомазоте, затем инкубировали в экстракционном буфере (100 мМ трис-HCl, 20 мМЭДТА, 2% в./об.

ЦТАБ, 1,4 M NaCl) при 60°C в течение 40 минут, добавляли 500мклсмесихлороформ/изоамиловыйспирт(24:1),перемешивалипереворачиванием 30-40 мин, центрифугировали в течение 20 минут при 12000оборотов в минуту, отбирали супернатант в чистую пробирку, добавляли половинуобъёма изопропанола, инкубировали 30 минут при +4°С, центрифугировали в63течение 20 минут при 12000 оборотов в минуту, промывали осадок холодным 70%этанолом, высушивали осадок под током воздуха в ламинаре (20-40 мин. взависимости от объёма осадка) и растворяли в 100 мкл воды.Выделение ДНК из растений для генотипирования осуществляли спомощью следующего протокола: молодые листья собирали в пробирки ирастирали с помощью пестика. Добавляли 400 мкл буфера для экстракции (200мМ трис-HCl, 250 мМ NaCl, 25 мМ ЭДТА, 0.5% в./об.

додецилсульфата натрия) ицентрифугировали в течение 5 минут при 12000 оборотов в минуту. 300 мклсупернтанта переносили в новую пробирку. Добавляли 300 мкл изопропанола иперемешивали переворачиванием 5 раз. Инкубировали пробы при -20°С в течение30 минут и центрифугировали в течение 5 минут при 12000 оборотов в минуту.Удаляли супернатант, осадок промывали 500 мкл 75% этанола, высушивали втечение 5-10 минут в ламинаре и растворяли в 100 мкл водыПЦР для клонирования осуществляли с помощью полимеразы Phusion(Thermo Scientific, США) в соответствии с инструкциями производителя.

ПЦР длягенотипирования и прочих нужд осуществляли с помощью Taq-полимеразы(Евроген, Россия) в соответствии с инструкциями производителя..Выделение плазмидной ДНК из бактерий осуществляли с помощью набораPlasmid Miniprep (Евроген) в соответствии с инструкциями производителя.Приготовление компетентных клеток бактерий E.coli проводили последующему протоколу:Клетки E.coli (штамм DH5 alpha) рассевали на чашку с твёрдой средой LB ивыращивали в течение ночи.