Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 11

В подтверждение этойгипотезы, в одном из исследований обработка эксплантов линии M9-10aазацитидином(неметилируемыйаналогцитозина),вызывающимгипометилирование, привела к полной потере их эмбриогенных свойств (Santos,Fevereiro, 2002).Эпигенетические изменения в ходе СЭ являются, по меньшей мере отчасти,причинойявлениясомаклональнойизменчивости-фенотипическойнеоднородности растений, регенерировавших из клеточных культур. Зачастую этанеоднородноcть касается развития цветков. В качестве примера можно привестисомаклональнуювариацию“mantled”возникающуюурегенерировавшихрастений масличной пальмы (Elaeis guineensis).

Растения с этим нарушениемформируют аномальные цветки и плоды низкого качества или непригодные купотреблению. Данная особенность может наследоваться в ряду поколений.Недавнее исследование показало, что причиной этой вариации является потеряметилирования в транспозоне Karma, находящемся в гене ТФ DEFICIENS,регулирующего развитие цветка.

Гипометилирование Karma влияет на сплайсинггена и приводит к синтезу его укороченного транскрипта, что и влечёт за собойформирование аномальных цветков (Ong-Abdullah et al., 2015).С эпигенетическими изменениями, по видимому, связано также явлениепривыкания к гормонам, при котором растения, которые долго культивируют invitro, становятся способными обходиться без экзогенных регуляторов роста, такихкак ауксин и цитокинин.

У A. thaliana был выявлен повышенный уровеньэкспрессии ряда генов, отвечающих за метилирование ДНК и модификациигистонов в каллусах с гормон-независимым ростом по сравнению с обычнымикаллусами (Pischke et al., 2006).В целом, уровень метилирования ДНК в эмбриогенных каллусах обычнониже, чем в неэмбриогенных, что было показано, например, на Eleutherococcussenticosus (Chakrabarty et al., 2003) и Pinus nigra (Noceda et al., 2009), поэтомуможно предположить, что гипометилирование ДНК является одним из сигналов,54индуцирующихСЭ.Темнеменее,искусственноеснижениеуровняметилирования, например, с помощью азацитидина, может привести как кувеличению эмбриогенных свойств, так и к их потере, в зависимости от сроков, накоторых подавляют метилирование, от исследуемого вида и даже сорта растениякак было, например, показано на Daucus carota (Yamamoto et al., 2005) и Accasellowiana (Fraga et al., 2012).На уровень метилирования ДНК в каллусе может влиять множествофакторов, таких как возраст экспланта, температура, источник азота, а такжефитогормоны.

Так, показано влияние ауксинов на уровень метилирования, причёмхарактер этого влияния зависит не только от концентрации гормонов, но и от типаиспользуемого ауксина (De-la-Peña et al., 2015).Уровень метилирования ДНК в ходе каллусообразования и регенерацииможет значительно изменяться. Так, на Populus trichocarpa было показано, чтопри формировании каллуса из стеблевых эксплантов уровень метилированияувеличивается примерно в полтора раза, а затем опять снижается в новыхрегенерировавших растениях (Vining et al., 2013).

В СЭ у Cucurbita pepoмаксимальные уровни метилирования ДНК наблюдаются на ранних этапахразвития эмбрионов, и по мере их развития уровень метилирования постепенноснижается (Leljak-Levanić et al., 2004).Модификации гистонов также играют важную роль в регуляции СЭ. Вчастности, у мутантов A. thaliana по гену KRYPTONITE/SUVH4, кодирующемуметилтрансферазу, добавляющую репрессирующую метку H3K9, значительноснижена способность к каллусообразованию (Grafi et al., 2007).

На Coffeacanephora наблюдали практически полное исчезновение репрессирующей меткиH3K9me2 на ранних этапах формирования эмбриогенного каллуса. В дальнейшем,во время развития соматических эмбрионов, метка вновь появлялась, как вкаллусах в целом, так и непосредственно в зародышах. Также были обнаруженыизменения состава гистоновых меток в локусах, кодирующих гомологи ТФ LEC1и BBM1, коррелирующие с уровнями их экспрессии (Nic-Can et al., 2013).Некоторыемодификациигистоноввовлеченывпроцесс55дедифференцировки клеток экспланта и делают возможным переход в S-фазуклеточного цикла (Us-Camas et al., 2014).Регуляция действия ауксина в ходе культивирования in vitro также во многомопределяется эпигенетическими модификациями: при развитии каллуса излистовых эксплантов происходит снятие репрессирующих меток H3K27me3 сгенов, отвечающих за ауксиновый сигналинг, а работа генов, регулирующихразвитие листа, напротив, оказывается подавлена за счёт этих же меток.

Умутантов по генам CURLY LEAF и SWINGER, отвечающих за добавление метокH3K27me3, развитие каллуса из листовых эксплантов подавлено, видимо, из-затого, что гены, регулирующие развитие листа, не удаётся репрессировать. В то жевремя корневые экспланты таких мутантов способны к формированию каллуса, тоесть, формирование каллуса из корня не требует репрессии каких-либо генов, поменьшей мере с помощью H3K27me3 (He et al., 2012).Таким образом, в клеточных культурах растений in vitro происходятсерьёзные эпигенетические изменения, сравнимые с таковыми при половомразмножении.

Эти изменения могут быть причиной проблем, связанных сискусственным размножением растений, таких как сомаклональная изменчивость,однако подробное изучение механизмов этих процессов позволит решить этипроблемы или даже добавлять новые полезные черты растениям, размножаемымin vitro.1.3. ЗаключениеК настоящему моменту накоплено большое количество данных о различныхучастниках ЗЭ и во многих случаях подробно изучены механизмы их работы. В тоже время, изучение СЭ находится на значительно более ранней стадии: этотпроцесс намного менее стабилен и его механизмы могут сильно различаться уразных видов.В изучении СЭ у растений можно выделить несколько этапов илинаправлений:1) Разработка методов получения соматических эмбрионов у разных видоврастений,562) Выявление факторов, влияющих на СЭ3) Поиск маркеров и участников СЭ и выяснение механизмов их работыРазработка методов СЭ до сих пор является в большой степениэмпирическим процессом, так как влияние различных факторов на этот процессможет быть разнонаправленным и меняться в зависимости от вида растения,наличия или отсутствия других факторов и пр.

Тем более важным является поискмаркеров СЭ – например, генов, уровень экспрессии которых увеличивается наразных этапах этого процесса. Изучение работы этих генов позволило глубжепонять механизмы СЭ а также то, каким образом, через каких посредников влияютна него гормоны и другие факторы, для которых ранее была показана ихзначимость для СЭ.Гены семейства WOX являются важнейшими регуляторами развитиямеристем, и неудивительно, что некоторые из этих генов оказались маркерами СЭ- процесса, при котором происходит образование меристем de novo.Ауксин - основной регулятор СЭ, и полярный транспорт ауксина,опосредуемый белками PIN, несомненно, важен для закладки новых меристем входе СЭ. Однако к настоящему времени лишь для гена PIN1 A.

thaliana показаноучастие в развитии соматических эмбрионов.В настоящем исследовании предпринята попытка ответить на следующиевопросы: какие гены WOX и PIN участвуют в СЭ у Medicago truncatula? Каковхарактер их экспрессии? Как они влияют на данный процесс и каковы возможныемеханизмы их работы?572. Материалы и методыРастительный материал. В работе использовали растения Medicagotruncatula Gaertn линий A17, 2HA, полученных из сорта Jemalong, и линии R-108,полученной из экотипа 108-1.

Семена линии A17 любезно предоставленыколлегами из Вагенингенского университета (Нидерланды). Семена линии 2HAлюбезно предоставила доктор Мирей Шабо (лаборатория растительно-микробныхвзаимодействий, Озвиль-Толозан, Франция). Семена линии R-108 любезнопредоставлены коллегами из Института Сэмюэля Робертса (США).Также в работе использовали трансгенные растения M.

truncatula линии R108 со встроенными в геном конструкциями для сверхэкспрессии генаSTENOFOLIA и для анализа экспрессии генов STENOFOLIA и MtWOX9-1,любезно предоставленные доктором Миллионом Тадеге (ГосударственныйУниверситет Оклахомы, США), а также трансгенные растения для анализаэкспрессии гена SMOOTH LEAF MARGIN 1 (любезно предоставлены профессоромЖенг-Ю Вангом из Института Сэмюэля Робертса, США).В работе были также использованы растения из коллекции инсерционныхмутантов Medicago truncatula (http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) ИнститутаСэмюэля Робертса, США, линий NF0075 (любезно предоставлены докторомМиллионом Тадеге, Государственный Университет Оклахомы, США), NF8274 иNF7292.Штаммы микроорганизмов.

Для трансформации растений M. truncatulaиспользовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL1, любезно предоставленныйколлегамиизтрансформацииГосударственногорастенийУниверситетаNicotianaОклахомыbenthamiana(США).использовалиДляштаммAgrobacterium tumefaciens GW2260, любезно предоставленный коллегами изГосударственного Университета Оклахомы (США). Для получения генетическихконструкций использовали штамм Escherichia coli DH5α.