Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 8

Считается, что в целомауксин препятствует интернализации PIN и стимулирует собственный транспорт,хотя для PIN2 показано, что и низкие, и высокие концентрации ауксина,существующие длительное время, приводят к деградации PIN2 (Baster et al., 2013).Другие фитогормоны также оказывают влияние как на транскрипцию геновPIN, так и на посттрансляционную судьбу белков. В частности, цитокинины могутстимулировать или подавлять экспрессию различных PIN в корне (Ruzicka et al.,2009), а при образовании латерального корня цитокинины стимулируютинтернализацию и последующую деградацию переносчиков PIN1, модулируя38направление ауксинового потока (Marhavý, et al., 2014).Гиббереллины, напротив, препятствуют эндоцитозу PIN, стабилизируя их наплазмалемме (Löfke et al., 2013).1.2.3.2.

Другие фитогормоны и их роль в СЭЦитокинины - другой класс фитогормонов, обычно необходимый для СЭ,являются важными факторами пролиферации клеток. Исследовано их участие вмножестве процессов в жизни растения, таких как развитие побега, морфогенезсосудов, старение и прочее. Однако их влияние на СЭ также неоднозначно. Угороха и сои добавление цитокининов в среду на ранних этапах подавляетиндукцию СЭ (Lakshmanan, Taji, 2000). Однако, у некоторых других видовцитокинины как раз способствуют этой индукции. (Asano et al., 1996, Castillo,Smith,1997).Цитокининыявляютсяхорошоизвестными стимуляторамипобегообразования, и зачастую обработка каллусов экзогенными цитокининамиприводит к регенерации, которая проходит не по пути СЭ, а по пути органогенеза- формирования побегов.Однако, несмотря на очевидно ведущую роль ауксина в развитиисоматических эмбрионов, существуют протоколы, в которых единственнымрегулятором роста, добавляемым в среду для культивирования, являетсяцитокинин: например, такие протоколы разработаны для гвоздики Dianthuscaryophyllus (Karami et al., 2007) и подсолнечника Helianthus annuus (Thomas et al.,2004).

Роль экзогенного цитокинина в СЭ, по-видимому, связана с егоспособностьюстимулироватьклеточныеделения,необходимыедляформирования эмбриогенного каллуса (Karami et al., 2009). Эндогенныецитокинины в каллусе, вероятно, выполняют множество функций; в частности,было показано, что для формирования КАМ соматических эмбрионов необходимцитокининовый сигналинг, и максимум цитокининового ответа ассоциирован сзоной экспрессии WOX5 - маркера покоящегося центра КАМ (Su et al., 2015).Об участии этилена в процессах СЭ обычно говорят в связи со стрессовымответом: перевод растения в культуру in vitro включает в себя множестворазличных стрессовых воздействий, о чём будет рассказано далее. Этилен39является одним из важнейших растительных гормонов, ассоциированных сострессовым ответом, поэтому его уровень в эксплантах и каллусах обычноповышен по сравнению с интактными тканями растения. Тем не менее, этиленхарактеризуется неоднозначным влиянием на эффективность СЭ.

Так, былопоказано, что он может подавлять СЭ у моркови (Tisserat, Murashige, 1977).Сходные данные были получены и для кофе (Giridhar et al., 2004). С другойстороны, у M. truncatula был выявлен положительный эффект этилена наэмбриогенность: обнаружен этилен-чувствительный ТФ MtSERF (SOMATICEMBRYO RELATED FACTOR 1), важный для СЭ. Кроме того, подавлениепередачи этиленового сигнала у этого вида подавляет СЭ, а индукция синтеза,напротив, его стимулирует (Mantiri et al., 2008).Согласно недавним данным, полученным на A. thaliana, синтез этилена вкаллусе активно происходит на начальных этапах развития. Затем, после удаленияэкзогенного ауксина из среды, интенсивность как синтеза этилена, так и передачиего сигнала, снижается, что необходимо для формирования соматическихэмбрионов.

Стимуляция синтеза или сигналинга этилена на этих этапах подавляетСЭ. Показано, что избыток этилена на этом этапе подавляет транскрипцию геновYUCCA, отвечающих за синтез эндогенного ауксина и формирование егоградиента - необходимое условие для развития соматических эмбрионов (Bai et al.,2013).Абсцизовая кислота (АБК) в ЗЭ в основном регулирует переход в стадиюпокоя и дальнейшее прорастания.

Несмотря на то, что соматические эмбрионыобычно развиваются без перехода в стадию покоя, АБК оказывает существенноевлияние на СЭ. Как и этилен, АБК является гормоном, ассоциированным сострессом, поэтому её синтез также может активироваться при переводе растения вкультуру in vitro. Было показано увеличение количества эндогенной АБК вэмбриогенных каллусах по сравнению с неэмбриогенными у Cucumis melo(Nakagawa et al., 2001).

У многих видов обработка экзогенной АБК оказываетстимулирующее воздействие на СЭ (Li, Qu, 2002, Fernando, Gamage, 2000), а дляморкови описан протокол получения соматических эмбрионов, в котором в40качестве экзогенного фитогормона используется только АБК (Nishiwaki et al.,2000).Важным ТФ, необходимым для передачи сигнала АБК в ходе созреваниясемян, является ABI3.

У моркови экспрессия гомолога ABI3, гена C-ABI3, а такжегенов, кодирующих так называемые белки, ассоциированные с эмбриогеннымиклетками (ECP, Embryogenic Cell Proteins), активируется перед формированиемсоматических эмбрионов, и было показано, что C-ABI3 индуцирует гены ECP(Karami, Saidi, 2010).Гиббереллины в целом считаются негативными регуляторами СЭ:повышенныйуровеньэндогенныхгиббереллиновсвязансоснижениемэмбриогенности (Pullman et al., 2004), и экзогенные гиббереллины уменьшаютинтенсивность СЭ (Tokuji, Kuriyama, 2003). На сое показано, что некоторые гены,кодирующие ТФ с доменом DELLA, отвечающие за подавление гиббереллиновогосигнала, активируют свою экспрессию в ходе СЭ (Zheng et al., 2013).

В то жевремя, гиббереллины могут оказывать положительный эффект на более поздниестадии СЭ. В частности, у Cynodon dactylon гиббереллины стимулируют развитиесоматических эмбрионов во взрослые растения (Li, Qu, 2002).Таким образом, все исследованные в этом аспекте фитогормоны оказываютвоздействие на интенсивность и особенности СЭ, однако характер этоговоздействия может меняться в зависимости от типа гормона, условийкультивирования и вида растений. Несмотря на это, были выявлены отдельныесигнальные пути, посредством которых различные гормоны, например, этилен,регулируют СЭ.1.2.4.

Транскрипционные факторы и эффекторные белки,регулирующие СЭВажнейшими участниками СЭ являются ТФ группы LEAFY COTYLEDON(LEC): LEC1, LEC2 и FUSCA3 (FUS3). Как уже было сказано выше, эта группаобъединяет два разных класса ТФ: LEC1 - субъединица HAP3 транскрипционногофактора, связывающего мотив CCAAT (Lotan et al., 1998), в то время как LEC2 и41FUS3 – близкородственные ТФ с доменом B3 (Stone et al., 2001, Luerssen et al.,1998).ЭктопическаяэкспрессиягеновLECпридаётвегетативнымирепродуктивным тканям эмбриогенные свойства: например, сверхэкспрессияLEC1 подавляет прорастание, а сверхэкспрессия LEC2 (и, в редких случаях, LEC1)приводит к появлению соматических эмбрионов в вегетативных тканях (Lotan etal., 1998, Stone et al., 2001).

Гены LEC участвуют в процессе созревания, регулируядействия абсцизовой кислоты и гиббереллинов, а также связаны с работойауксина: в частности, LEC1 и LEC2 участвуют в метаболизме и сигналингеауксина, стимулируя экспрессию генов синтеза ауксина группы YUCCA, а такжерегуляторов ауксинового ответа IAA (Braybrook et al., 2006).

Экспрессия генаFUSCA3 стимулируется ауксином (Gazzarrini et al., 2004). Предполагается, чтогены LEС способны придавать тканям эмбриональные свойства именно за счётсвоей связи с действиями ауксина (Hand et al., 2016).Интересно, что в геноме растения Kalanchoë daigremontiana, известногосвоей способностью к СЭ in vivo, гомолог гена LEC1 кодирует усечённую версиюбелка LEC1, которая не может восстановить мутацию lec1 у A. thaliana. В то жевремя, трансформация K.

daigremontiana версией KdLEC1 с добавленныминедостающими нуклеотидами приводит к получению растений, неспособных кСЭ in vivo. Эти данные позволяют предположить, что мутация в гене LEC1 иявляется причиной необычных эмбриогенных свойств вида K. daigremontiana(Garcês et al., 2014).Другим ТФ, для которого было показано участие в СЭ, является белокBABYBOOM (PLETHORA 4), принадлежащий к семейству AINTEGUMENTALIKE (AIL) транскрипционных факторов с ДНК-связывающим доменом AP2/ERF(APETALA 2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR).

ТФ BABY BOOM 1 и BBM2впервые были идентифицированы у Brassica napus, и затем был найден ихгомолог у A. thaliana (BBM). Сверхэкспрессия BBM1 и 2 в растениях A. thaliana иB. napus приводит к спонтанному образованию соматических эмбрионов навегетативных органах, а также к ряду других изменений, которые в целомотражают увеличение пролиферативной активности и способности к регенерации42(Boutilier et al., 2002). Сходный эффект эктопической экспрессии в растениях A.thaliana – образование соматических эмбрионов на вегетативных тканях – былпоказан и для близкого гомолога BBM – гена EMBRYOMAKER (AIL5/CHO1(CHOTTO1)/PLETHORA5).

Кроме того, сверхэкспрессия и потеря функции этогогена приводили, соответственно, к увеличению и к уменьшению эмбриогенностикаллусов (Tsuwamoto et al., 2010).ТФ с MADS-доменом AGAMOUS-LIKE15 также, как было показано,является стимулятором и маркером СЭ у различных видов (Harding et al., 2003,Heck et al., 1995, Zheng et al., 2013). Выявлены разные механизмы, объясняющиеэтот эффект: в частности, показано, что AGL15 и его гомолог у Glycine maxиндуцируют экспрессию гена, гомологичного MtSERF1 (M. truncatula SOMATICEMBRYO RELATED FACTOR1), этилен-чувствительного стимулятора СЭ, асверхэкспрессия AGL15 приводит к увеличению продукции этилена, что в своюочередь увеличивает интенсивность СЭ у A.

thaliana и сои (Zheng et al., 2013).AGL15 также стимулирует экспрессию гена гиббереллин-оксидазы AtGA2ox6,инактивирующей гиббереллины (Wang et al., 2004).Изучалась также работа в ходе СЭ гена SERK (SOMATIC EMBRYOGENESISRECEPTOR KINASE), кодирующего белок, принадлежащий к группе рецепторныхкиназ с лейцин-богатыми повторами.

Первый ген SERK (DcSERK) былиденцифицирован у моркови в качестве маркера эмбриогенных клеток всуспензионной культуре. Кроме того, его экспрессию наблюдали в ходе СЭ и ЗЭдо глобулярной стадии (Schmidt et al., 1997). Сходным образом экспрессируютсягомологи этого гена у других двудольных. В частности, у арабидопсиса генAtSERK1 транскрибируется при формировании эмбриогенных клеток в культуре, входе раннего ЗЭ и в зародышевом мешке.

При этом экспланты из проростковарабидопсиса,вкоторыхиндуцировалисверхэкспрессиюAtSERK1,демонстрировали способность к эмбриогенезу в три-четыре раза выше, чемобычные экспланты (Hecht et al., 2001). Экспрессию гомологов SERK1 наблюдалине только при СЭ или ЗЭ, но также и в ходе апомиксиса, что было показано наразных видах растений (Hand et al., 2016).43Показано,чтобрассиностероидов,AtSERK1образуяучаствуеткомплексысвпутиBRI1передачисигнала(BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 1) и AtSERK3, а также в мужском спорогенезе (Albrecht et al., 2008,Santiago et al., 2013). В отличие от большинства видов, у M.