Диссертация (Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula), страница 18

Однако мы обнаружили, что в каллусах сосверхэкспрессией STF снижен уровень экспрессии гена MtGH3.6, регулирующегометаболизм ауксина (Рисунок 11, а) (Yang et al., 2015).Рисунок 11. Экспрессия генов MtGH3.6 и MtHB1 в каллусах. а-б: ЭкспрессияMtGH3.6 (а) и MtHB1 (б) в каллусах дикого типа и в каллусах со сверхэкспрессией103STF, полученных из листовых эксплантов. Эксперимент проводили в двух илитрёх биологических повторностях. Планки погрешностей указывают стандартныеотклонения. в-г: динамика экспрессии MtGH3.6 (в) и MtHB1 (г) в ходекультивации эксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) инеэмбриогенной линии A17 (пунктирная линия) в условиях, способствующихпоявлению соматических зародышей.

Эксперимент был проведён в двухбиологических повторностях, в них наблюдалась сходная динамика экспрессииисследуемого гена. На рисунке представлена одна серия проб, планкипогрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанные для трёханалитических повторностей.Мы проанализировали динамику экспрессии MtGH3.6 в ходе СЭ. Данныйэксперимент проводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогенной линиейA17, аналогично экспериментам с генами WOX и PIN (см. раздел «3.1.

Выявлениегенов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматического эмбриогенеза»). Мывыявили повышенный уровень экспрессии MtGH3.6 в линии A17 по сравнению слинией 2HA на поздних стадиях культивирования, соответствующих развитиюсоматических зародышей у эмбриогенной линии (Рисунок 11, в). Таким образом,пониженныйуровеньэкспрессииMtGH3.6ассоциировансповышениемэмбриогенности, как в случае каллусов со сверхэкспрессией STF, так и в случаекаллусов эмбриогенной линии 2HA.Гены семейства GH3 кодируют ферменты, осуществляющие метаболизмауксина и жасмоновой кислоты. Они способны присоединять к этим гормонамразличные аминокислоты, тем самым либо стимулируя их деградацию, либо,напротив, их активацию.

Ближайшим гомологом MtGH3.6 у A. thaliana являетсяген GH3.1, продукт которого, предположительно, переводит ауксин в неактивнуюформу (Yang et al., 2015). С другой стороны, MtGH3.6, как и многие гены этогосемейства,являетсяауксин-чувствительнымгеномиобладаетауксин-индуцибельным промотором (Yang et al., 2015).Сниженный уровень экспрессии MtGH3.6 в каллусах со сверхэкспрессией104STF может говорить о повышении уровня свободного ауксина в каллусах(вследствие уменьшения уровня экспрессии гена, инактивирующего ауксин),либо, напротив, о сниженном уровне ауксинового ответа (маркером которогоявляется уровень экспрессии MtGH3.6).

Однако, поскольку мы не выявилиизменений уровней экспрессии других ауксин-чувствительных генов (например,генов SAUR), мы предполагаем, что более вероятным является первый вариант:снижение уровня экспрессии MtGH3.6 в данном случае приводит к увеличениюконцентрации свободных ауксинов или к изменению градиента ауксинов вкаллусе. Такие изменения могут быть недостаточными для детектируемогоизменения уровней экспрессии ауксин-чувствительных генов, но достаточнымидлятого,чтобыстимулироватьразвитиедополнительныхсоматическихзародышей.Помимо этого, мы обнаружили, что в каллусах со сверхэкспрессией STFуменьшенуровеньэкспрессиигенаMtHOMEOBOXPROTEIN1(MtHB1),кодирующего ТФ, предположительно, участвующий в сигналинге абсцизовойкислоты (Ariel et al., 2010) (Рисунок 11, б).

Мы также проанализировали динамикуэкспрессии MtHB1 в ходе культивирования in vitro в каллусах эмбриогеннойлинии 2HA и неэмбриогенной линии A17 и обнаружили, что этот гендемонстрируетповышенныеуровниэкспрессиинапозднихстадияхкультивирования каллусов обоих линий. Однако, в каллусах линии A17наблюдаемое повышение было более существенным по сравнению с каллусамилинии 2HA (Рисунок 11, г). Таким образом, более интенсивная транскрипцияMtHB1 ассоциирована с развитием неэмбриогенного каллуса.Ген MtHB1 кодирует транскрипционный фактор из класса HDZip I.Показано, что он активируется в стрессовых условиях и в ответ на обработкуабсцизовой кислотой, и подавляет развитие боковых корней (Ariel et al., 2010).Ближайшим гомологом MtHB1 у A.

thaliana, согласно базе данныхPhytozome, является ген ATHB12, регулирующий действие абсцизовой кислоты игиббереллинов (Valdés et al., 2012, Son et al., 2010).Таким образом, можно предположить, что изменение уровня экспрессии105гомолога ATHB12 – MtHB1 – связано с изменениями в метаболизме и сигналингегиббереллинов и абсцизовой кислоты, известных регуляторов СЭ, и этиизменения коррелируют с повышением эмбриогенности каллуса.Помимо этого, в одном из последних исследований показано, что ATHB12стимулирует рост клеток и их эндоредупликацию (Hur et al., 2015). Оба этихпроцесса ассоциированы с дифференцировкой клеток и выходом из клеточногоцикла (Gutierrez et al., 2005).Мыпредполагаем,ингибированиемпролиферативнойчтопроцессовактивности,подавлениеэкспрессиидифференцировкичто,возможно,связаноMtHB1клетокисподдержаниемспособствуетповышениюинтенсивности СЭ.Согласно ранее полученным данным, уровень экспрессии MtGH3.6 и MtHB1в побегах растений с потерей функции STF также понижен (Tadege et al., 2011) —то есть, и сверхэкспрессия STF в каллусе, и потеря функции этого гена в побегемогут приводить к сходным изменениям в уровне экспрессии этих генов.

Исходяизэтого,можнопредположить,чтоMtGH3.6иMtHB1неявляютсянепосредственными мишенями STF, и изменения их активности в каллусах сосверхэкспрессией STF являются, скорее, следствием каких-либо более общихизменений в регуляции гормонального метаболизма.Также мы предположили, что различия в экспрессии генов-мишенейнаблюдаются на более ранних стадиях, поэтому мы измерили экспрессиюнесколькихисследованныхгенов(MtGH3.6,MtHB1,Medtr4g078710,Medtr8g076040, Medtr1g025250) в каллусах на стадии 30 дней с момента началакультивации, однако не выявили достоверных различий по уровню экспрессииэтих генов между каллусами разных генотипов (результаты не представлены).Аналогичный эксперимент мы провели, используя каллусы растений спотерей функции гена STF (генотип stf) (25 шт.) и, в качестве контроля, каллусыдикого типа (29 шт.) К нашему удивлению, потеря функции STF не снизилаэмбриогенность каллусов и даже привела к небольшому увеличению степениэмбриогенности (p<0,05) (Рисунок 12).106Аналогичным образом, мы измерили уровни экспрессии 25 предполагаемыхгенов-мишеней STF в СЭ (см.

Таблицу 6) в этих каллусах и сравнили их стаковыми в каллусах дикого типа на стадии 60 дней с момента началакультивирования, однако различий не выявили (данные не представлены).Рисунок 12. (а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами.Верхний ряд — каллусы stf. Нижний ряд — каллусы дикого типа. (б) Средняядоля поверхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа икаллусов stf. Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные спомощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).Такимобразом,врезультатеисследованияСЭурастенийсосверхэкспрессией и с потерей функции гена STF, мы показали, что приобретениефункции STF приводит к увеличению эмбриогенности, а потеря функции STF неснижает эмбриогенность.

Следовательно, хотя STF, вероятнее всего, участвует вСЭ, его функции не являются необходимыми для этого процесса.,Мы провели сравнительный анализ экспрессии 25 предполагаемых геновмишеней в каллусах дикого типа и в каллусах с потерей или приобретениемфункции STF на стадии формирования соматических зародышей. В результате,несмотря на статистически достоверные различия в интенсивности СЭ междукаллусами разных генотипов, мы обнаружили только два гена, уровни экспрессиикоторых различались в каллусах дикого типа и в каллусах со сверхэкспрессией107STF.

При этом гены, ассоциированные с СЭ, не демонстрируют таких различий.Посколькуобаэтихгенасвязанысработойфитогормонов,мыпредполагаем, что сверхэкспрессия STF приводит к изменению гормональногобаланса каллуса в целом или к перераспределению тех или иных гормонов внутрикаллуса, что и повышает интенсивность СЭ. При этом изменения в экспрессиигенов, ассоциированных с СЭ, также имеют место в каллусах STFoe, однако онипроисходят только на поверхности каллуса – там, где формируются соматическиеэмбрионы, поэтому их невозможно выявить, измеряя уровень экспрессии вкаллусах целиком.Кроме того, различия в уровнях экспрессии предполагаемых генов-мишенейв каллусах разных генотипов могут возникать на более ранних стадиях СЭ(например, на этапах 40 и 50 дней культивирования), а впоследствии исчезать.Дальнейшие исследования, в частности, подробный анализ динамикиэкспрессии предполагаемых генов-мишеней в ходе СЭ, а также локальный анализэкспрессии ряда регуляторов СЭ в каллусах с изменённой экспрессией STFпомогут подтвердить или опровергнуть наши предположения, а также выявитьнепосредственные мишени STF в эмбриогенном каллусе.3.2.2.2.

Анализ способностей к СЭ у растений сосверхэкспрессией гена MtWOX9-1КоллегиизГосударственногоУниверситетаОклахомылюбезнопредоставили нам семена растений с конструкцией для сверхэкспрессии генаMtWOX9-1.Мы получили каллусы этих растений и сравнили интенсивность СЭ стаковой у каллусов растений дикого типа. Было проанализировано 20 каллусов сосверхэкспрессией MtWOX9-1 и 24 каллуса дикого типа.В ходе эксперимента мы обнаружили, что первые видимые невооружённымглазом соматические эмбрионы появляются на каллусах со сверхэкспрессиейMtWOX9-1 приблизительно на 10 дней раньше, чем на каллусах дикого типа.Интенсивность СЭ, измеренная аналогично предыдущим экспериментам, укаллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1 была значительно выше, чем у каллусов108дикого типа (p<0,01) – возможно, вследствие того, что период формированияновых соматических эмбрионов был больше в случае трансгенных каллусов(Рисунок 13).Рисунок 13.

(а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами (60день культивации). Верхний ряд — каллусы со сверхэкспрессией MtWOX9-1.Нижний ряд — каллусы дикого типа. (б) Средняя доля поверхности каллуса,занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа и каллусов со сверхэкспрессиейMtWOX9-1. Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные спомощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).С целью поиска предполагаемых генов-мишеней MtWOX9-1 в ходе СЭ, мыизмерили уровни экспрессии нескольких генов, экспрессия которых, согласнонашим данным, ассоциирована с СЭ, на стадиях 30 и 60 дней с момента началакультивации в каллусах дикого типа и в каллусах со сверхэкспрессией MtWOX9-1.Мы взяли в анализ следующие гены: MtWOX11-like, STF, SLM1, MtAGL15, MtSHRи MtLEC1A.

В отличие от каллусов с изменённым уровнем экспрессии гена STF, вданном случае все анализируемые нами гены изменяли характер экспрессии вкаллусах со сверхэкспрессией MtWOX9-1 (Рисунок 14).Часть генов (MtWOX11-like, MtAGL15, MtLEC1A) повышала уровеньэкспрессии в каллусах со сверхэкспрессией MtWOX9-1 по сравнению с каллусамидикого типа на стадии 30 дней.

Ген SLM1 (единственный из исследованных)продемонстрировал сниженный уровень экспрессии на стадии 30 дней. При этом109на стадии 60 дней у генов MtAGL15, MtLEC1A, MtSHR и SLM1 снижался уровеньэкспрессии, а у гена STF (единственного из исследованных) - повышался (Рисунок14).Гены MtWOX11-like, MtAGL15, MtLEC1A и MtSHR имели сходную динамикуэкспрессии в ходе развития каллуса у эмбриогенной линии 2HA: низкий уровеньна этапах каллусообразования и его повышение в ходе СЭ (см. Рисунок 4 вразделе «3.1.2. Количественный анализ экспрессии генов WOX Medicagotruncatula в зиготическом и соматическом эмбриогенезе» и Рисунок 10 в разделе«3.2.2.1.