Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 5

Так, например, былопоказано, что в неделящихся клетках млекопитающих и бактерий Escherichia coli урацил,появляющийся в ДНК в результате дезаминирования цитозина, и 8-оксогуанин,являющийся продуктом окисления гуанина, приводят к образованию аберрантноготранскрипта (мРНК) репортерного гена люциферазы [52-54]. В то же время, внеделящихся клетках без повреждений ДНК экспрессия гена люциферазы приводит кобразованиюнормальногобелка.Припоявленииповреждениявкодирующейпоследовательности гена люциферазы в результате транскрипции происходят ошибкивключения нуклеотидов и появляются мутантные молекулы мРНК.

Образование20большого числа аберрантных транскриптов и их последующая трансляция, которая можетпроисходить неоднократно, с высокой вероятностью приводит к образованию большогоколичествааномальногобелка.Показано,что8-оксогуанин,индуцированныйокислительными процессами, накапливается в геномной и митохондриальной ДНКнейронов,егоуровеньповышаетсясвозрастомиубольных,страдающихнейродегеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, Паркинсона ибоковым амиотрофическим склерозом.

Предполагают, что накопление мутантного белка,возникшего в результате транскрипции на матрице ДНК с 8-оксогуанином и последующейтрансляции,приводиткизменениюфенотипанейронов[45].Такимобразом,транскрипция на поврежденной матрице ДНК может индуцировать фенотипическиеизменения в неделящихся клетках [45, 55, 56]. Не исключено, что в делящихся клеткахпервичные повреждения также могут влиять на экспрессию генов, несмотря на то, чтопервичные повреждения существенно нарушают матричные процессы (в первую очередьрепликацию) и поэтому не могут существовать в клетке продолжительное время,поскольку нормальное функционирование и удвоение генома возможно только в условияхотносительно низкого содержания первичных повреждений.

На значение первичныхповреждений в генах, экспрессирующихся в "критические" периоды дифференцировкитканей в ходе эмбрионального развития, указывает образование морфозов у D.melanogaster [57, 58]. Таким образом, в современной литературе можно встретитьнекоторые примеры, подтверждающие возможность фенотипического проявленияпервичных повреждений, однако механизмы этого процесса мало изучены.Недостаток данных о влиянии первичных повреждений ДНК на фенотипорганизмов может быть вызван в том числе тем, что системы, позволяющие исследоватьсамостоятельное фенотипическое проявление первичных повреждений ДНК, а нерезультат их превращения в мутации и хромосомные аберрации, слабо разработаны.

Вгенетической токсикологии существуют сотни систем, позволяющих фиксироватьвозникновение различных хромосомных аберраций и мутаций по их фенотипу(изменению окраски колоний микроорганизмов, тела или глаз дрозофилы, появлениюустойчивости к какому-либо антибиотику, появлению ауксотрофности или другимпроявлениям) [59].

На практике для выявления мутационных изменений используют неболее 20 тестов. Первичные повреждения ДНК также можно выявлять в основномфизическими методами, предусматривающими разрушение клеток [12]. Тем не менее,такие методы не позволяют выявить связь между появлением первичного повреждения вопределенном участке генома с изменением конкретного фенотипического признака.211.4.

Методы выявления первичных повреждений ДНКДля определения количества повреждений в ДНК используют различныефизические и химические методы в зависимости от типа исследуемого повреждения.Например, одним из наиболее точных и распространенных методов для детекции одно- идвунитевых разрывов на уровне отдельной эукариотической клетки является метод ДНКкомет [60, 61]. Существует несколько модификаций метода, повышающих егочувствительность и расширяющих сферу применения [13]. Основные этапы исследованияотдельных клеток с помощью метода ДНК-комет заключаются в следующем:контрольные и обработанные мутагеном клетки заключают в агарозу, проводят их лизис,затем контролируемую денатурацию ДНК, разделение ДНК гель-электрофорезом вагарозе и окраску ДНК флуоресцентным красителем с последующей визуализацией ееследа и микроскопическим изучением образцов.

Денатурация и электрофорез в щелочныхусловиях позволяет выявлять однонитевые разрывы, в нейтральных условиях двунитевыеразрывы ДНК [13, 60, 62]. В основе этого метода лежит способность ДНК изменятьподвижность в электрическом поле. Наличие разрывов в ДНК приводит к нарушениюструктурной организации хроматина, происходит релаксация ДНК и ее фрагментация. Вэлектрическом поле фрагменты ДНК вытягиваются по направлению к аноду, образуяшлейф, напоминающий хвост кометы. В качестве показателя степени поврежденностиДНК в изучаемых клетках используют количество ДНК, мигрировавшей по направлениюк аноду.

Анализ ДНК-комет проводят либо визуально, с ранжированием комет на типы,либо с помощью специального программного обеспечения [62]. Метод ДНК-кометприменяют при исследовании апоптоза, эффектов антираковых препаратов, генетическойактивности различных химических агентов и фармацевтических препаратов, прибиомониторинге и оценке чувствительности организмов к загрязнению окружающейсреды [60, 63].Одно-идвунитевыеразрывыможновыявитьметодомтерминальногодезоксиуридинового мечения концов (TUNEL-метод) [12, 64].

Фрагментация ДНК иразрывы приводят к тому, что появляется свободный 3´-конец разорванной нити ДНК, скоторымспецифическиСвязываниесвязываетсяосуществляетсямеченныйферментомбиотинилидигоксигенин-дУТФ.дезоксинуклеотидтрансферазой.Детекциюсигнала осуществляют с использованием антител с флуоресцентными метками к биотинуили дигоксигенину.

Этот метод чаще всего применяют для изучения апоптоза. TUNELметод имеет ограничения по специфичности и надежности [12].22Еще одним из наиболее чувствительных методов выявления двунитевых разрывовявляетсяметод,основанныйнаиспользованиифлуоресцентныхантителкфосфорилированной форме гистона гамма-H2AX (γ-H2AX) [65-67]. Гистон Н2А послеприсоединения фосфата к серину в 139 положении приобретает способность связываться сконцами ДНК в области двунитевых разрывов. Фосфорилирование гистона H2A являетсяранним ответом клетки на образование двунитевых разрывов ДНК, индуцированныхионизирующим излучением или в ходе рекомбинации, и осуществляется посредствомактивации ДНК-зависимых киназ ATM, ATR и DNA-PK [66-68].

В результате индукцииответа на появление двунитевого разрыва, вблизи его концов на расстоянии до 2миллионов пар оснований (2-Mbp) образуются скопления фосфорилированного гистонаH2AX, насчитывающие тысячи копий этого белка [67]. Эти скопления окрашиваютфлуоресцентно мечеными антителами и детектируют с помощью люминесцентногомикроскопа.

В отличие от метода ДНК-комет, обладающего максимальной точностью вслучае наличия в клетках большого числа разрывов и фрагментов ДНК, метод детекциифосфорилированого гистона Н2А имеет высокую точность при наличии единичныхразрывов ДНК в ядре клетки.Фрагментацию ДНК можно выявить цитологическим методом в микроядерном тесте.Микроядра образуются из ацентрических фрагментов хромосом, возникших в результатеструктурных нарушений ДНК и не попавшие в клеточное ядро при делении клеток [69,70].Для выявления окислительных повреждений ДНК, в основном 8-оксогуанина, вклетках используют три подхода: газовую хроматографию в сочетании с массспектрометрией(GC-MS),высокоэффективнуюжидкостнуюхроматографиюсэлектрохимическим детектированием (HPLC-EC), и высокоэффективную жидкостнуюхроматографию с электроспрейной ионизацией и тандемной масс-спектрометрией (HPLCMS/MS) [71, 72].

HPLC-EC – точный и чувствительный метод, он позволяет определятьпроцентное содержание модифицированных оснований в гидролизованной ДНК [71]. Темне менее, этот метод трудоемок, а для достижения хороших результатов требуетсянесколько измерений для каждого образца, а также большое количество исследуемогоматериала [72]. Метод GC-MS менее точный, чем HPLC-EC, и требует дополнительнойдериватизации нуклеотидов (получения производных анализируемых молекул с цельюулучшения характеристик разделения и детекции), которая может индуцироватьокислительные повреждения оснований ДНК, что приводит к завышению уровняповреждений в клетке. Наиболее точным и чувствительным методом в настоящее время23является HPLC-MS/MS, который позволяет измерять низкий уровень повреждений ДНК ине требует длительной подготовки образцов, что снижает риск появления артефактныхповреждений.

Этот метод более автоматизирован по сравнению с GC-MS и HPLC-EC [72].HPLC-MS/MS можно применять для выявления апуриновых/апиримидиновых сайтов,циклобутановых-пиримидиновых димеров и 6-4 фотопродуктов, ДНК-аддуктов [73, 74].ПомимоHPLC-MS/MSповреждения,индуцированныеультрафиолетовымизлучением, можно выявлять, используя иммунологический метод с применениемразличных специфичных антител: радиоиммунный и иммуно-слот-блот анализ, а такжесочетая иммунологический подход с хромотографией и методом ДНК-комет или сблотингом и хемилюменисцентными методами [12, 64, 75, 76].Таким образом, к настоящему времени разработано несколько эффективныхметодов, позволяющих определять количество различных первичных повреждений вклетке. Их общим недостатком является то, что при использовании этих методовнеобходимо разрушать исследуемые клетки, что делает невозможным анализ дальнейшейсудьбы первичных повреждений и исследование влияния повреждений на фенотип.1.5.

Методы генетической токсикологии для выявления мутаций и хромосомныхаберрацийВ связи с продолжающимся ростом числа новых генетически активных факторовне ослабевает необходимость разработки методов и тест-систем, позволяющих надежно ибыстро выявлять потенциальную генетическую активность и проводить скринингбольшого числа химических и физических мутагенов.