Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 3

Еслипервичное повреждение произошло на стадии G1, то вероятность его самостоятельногофенотипического проявления в альфа-тесте является максимальной. Самостоятельноефенотипическое проявление первичных повреждений, возникших на стадиях S, G2 или М,может быть зафиксировано в альфа-тесте, если эти повреждения могут сохраняться вклеточном цикле до следующей стадии G1, в которой становится возможным ихпроявление.Степень достоверности и апробация результатов. Данные, представленные вдиссертации, опубликованы в трех статьях, в том числе, две статьи опубликованы врецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Материалы работы были представленыи доложены на восьми международных и Всероссийских конференциях: “Биология ифундаментальные проблемы медицины”, 2016, Санкт-Петербург, Россия; 25-ой, 26-ой и27-ой конференциях “International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology”,проходивших в 2011 году в г. Ольштын, Польша, в 2013 году в г. Франкфурт, Германия, ив 2015 году в г. Левико-Терме, Италия; VI Съезд Вавиловского Общества Генетиков иСелекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы, 2014, Ростов-наДону, Россия; Genome Instability, Evolution and Human Disease 2013, Санкт-Петербург,Россия; The 17th International Pushchino School Conference Of Young Scientists "Biology TheScience Of The XXI Century", 2013, Пущино, Россия; Третья научная конференции"Молекулярная генетика, биофизика и медицина" Бреслеровские чтения III, 2011, СанктПетербург, Россия.Достоверность экспериментальных данных, представленных в диссертации,подтверждена воспроизводимостью результатов экспериментов и доказана с применениемметодов математической статистики и современного программного обеспечения.11Глава 1.

Обзор литературы.Формирование представлений о мутационном процессе1.1. Первые гипотезы о причинах мутационных измененийПервые попытки описать и понять механизмы скачкообразных наследственныхизменений (мутаций) были предприняты на рубеже IXX и XX вв. Понятие "мутация" внаучный язык ввел Г. де Фриз в рамках разработанной им мутационной теории в 19011903 гг. [19, 20].

Де Фриза больше интересовала мутационная теория происхождениявидов, нежели теория мутационного процесса, которая позже возникла в школе Т. Х.Моргана после открытия индуцированного мутагенеза. До 1925 г. искусственно повыситьчастоту мутаций никому не удавалось. В то время генетики работали только соспонтанными мутациями, в связи с чем и появилась гипотеза о том, что мутационныйпроцесс не зависит от окружающей среды [19]. Эта гипотеза была опровергнута в работахГ. А.

Надсона и Г. С. Филиппова. В 1925-1926 гг. они показали, что под воздействиемлучей радия у грибов Мисоr genevensis, Zygorhynchus, Sporobolomyces и Nadsoniaповышаетсячастотапоявленияновыхнаследственныхформ.Благодаряэтомунаблюдению авторам удалось получить несколько стабильных рас грибов [21]. В 1927 г. Г.Дж. Мёллер продемонстрировал влияние рентгеновских лучей на мутационный процесс уDrosophila melanogaster и предложил количественный метод учета рецессивныхлетальных мутаций в Х-хромосоме дрозофилы [22, 23].

Результаты Мёллера былиподтверждены в работах C. K. Гэйжера, А. Блексли и Л. Дж Стадлера, в которых былопоказано влияние рентгеновских лучей и радия на мутагенез у дурмана, кукурузы иячменя [24-26]. Н. В. Тимофеев-Ресовский, воздействуя рентгеновскими лучами на яйца имолодые личинки дрозофилы, смог индуцировать соматические мутации [27]. Позже былопоказано, что рентгеновское, гамма- и ультрафиолетовое (УФ) излучения индуцируютразличные типы наследственных изменений генетического материала (генные мутации ихромосомные аберрации) как в половых, так и в соматических клетках, а частотаиндуцированных генетических нарушений зависит от дозы облучения.Одновременно с открытием мутагенного действия коротковолнового излучениябыл открыт химический мутагенез.

В 1928 г. М. Н. Мейсель индуцировал мутации удрожжей под действием хлороформа и других химических соединений [28]. В 30-е годыВ. В. Сахаров, М. Е. Лобашев и Ф. А. Смирнов показали, что йод, уксусная кислота иаммиак индуцируют рецессивные летальные мутации в Х-хромосоме у дрозофилы. В 1946г. были открыты сильные мутагены: этиленимин И. А. Рапопортом в СССР и азотистый12иприт Дж. Робсоном и Ш.

Ауэр-бах в Англии [1, 19, 29]. К настоящему моменту списокмутагенных факторов значительно расширился и включает десятки тысяч веществ,обладающих мутагенной активностью. С каждым годом число новых генотоксическихфакторов продолжает расти.Открытие индуцированного мутагенеза, позволившего искусственно изменятьскорость мутационного процесса, сделало возможным изучение его механизмов. Одна изпервых гипотез о причинах возникновения мутаций заключалась в том, что главнымисточником спонтанных мутаций является естественный фон радиации.

Тем не менее,эксперименты и расчеты показали, что доза, получаемая от естественного фона радиации,не может обеспечить наблюдаемую частоту возникновения спонтанных мутации [27].Влиянием естественного фона можно объяснить возникновение лишь около 0,1 % всехспонтанных мутаций у дрозофилы [19].

В 1935 г. Н. В. Тимофеев-Ресовский, К. Циммер иМ. Дельбрюк, основываясь на исследованиях радиационного мутагенеза у дрозофилы,сформулировали теорию попадания. Согласно этой теории, мутации возникают двумяспособами: при случайных колебаниях атомов или при получении энергии извне, т.е. врезультате попадания в ген кванта излучения происходит ионизация или возбуждениеатомов [27]. Ген рассматривали как блок атомов, в котором может произойти мутация,представляющая собой мгновенную перестановку атомов или диссоциацию связей вмомент ионизации. [27]. Была сформулирована теория структуры гена, основанная толькона его физико-химических свойствах, но не учитывающая биологическую функцию гена.Тем не менее, не все экспериментальные данные укладывались в данную модель.Мёллер, Тимофеев-Ресовский и Стадлер показали, что частота спонтанных мутаций удрозофилы пропорциональна температуре (рассматривался диапазон температур от 15 до29°С), при повышении температуры на 10°С происходило возрастание частоты мутагенезав три раза [27].

П. К. Шкварников и М. С. Навашин наблюдали увеличение скоростимутационного процесса при длительной тепловой обработке покоящихся семян Crepiscapillaris [30]. В 1933-39 гг. Ю. Я. Керкис опубликовал серию работ, в которых былапоказана связь между воздействием низкой температурой и частотой мутаций [31, 32]. В1935-36 гг. М. Е. Лобашев продемонстрировал, действие постоянной и колеблющейсятемпературы на развитие повреждений, индуцированных рентгеновскими лучами вполовых клетках дрозофилы [33]. М.

Е. Лобашев был не согласен с теорией попадания,объясняющей причины возникновения мутаций непосредственно физико-химическимиизменениями гена. Он указывал на то, что принцип попадания, рассматривающийизменение гена как одноактное молекулярное событие и установленный при изучении13летальных сцепленных с полом мутаций у дрозофилы при воздействии рентгеновскогоизлучения, причиной которых, как выяснилось, являются хромосомные нарушения, вдействительности не может описывать возникновение хромосомных аберраций и делецийнебольшой протяженности.

Эти события не могут возникнуть при попадании одногокванта излучения в ген, а для их появления требуется несколько одновременныхлокальныхизмененийодновременноговодномвозникновенияучасткехромосомы.несколькихизмененийПосколькуоченьмала,вероятностьачастотахромосомных нарушений при рентгеновском излучении достаточно велика, теорияпопадания не могла убедительно объяснить механизм появления хромосомных перестроек[33, 34]. В связи с этим появилось предположение о том, что физиологическое состояниеможет влиять на мутационный процесс [35]. Дальнейшие исследования мутагенезапоказали, что различные по своей природе внешние воздействия, с помощью которыхиндуцируют мутации, оказывают сходное действие на мутационный процесс.

Это даловозможностьпредположить,чторазличныемутагенымогутдействоватьнанаследственный материал сходным образом, а в основе мутационного процесса лежатнеспецифические повреждения клетки. Становилось все более понятно, что мутациивозникают в результате некоего процесса, который занимает время, а не в моментпрохождения кванта энергии, вызывающего ионизацию атомов гена [19]. Возниклагипотезаотом,чтомутациямдолжнопредшествоватьнекотороеобратимоепредмутационное состояние, которое может быть устранено. Эта гипотеза получила своеразвитие в работах Михаила Ефимовича Лобашева.1.2. Вклад физиологической теории мутационного процесса М. Е.

Лобашева вформирование современных представлений о мутационных измененияхгенетического материалаВпервыепредположениеосуществованиипредмутационных(первичных)повреждений генетического материала, и связи мутагенеза с процессом репарации былосформулировано М. Е. Лобашевым в 40-х гг. XX века. На основании работ Д. Н. Насоноваи В. Я. Александрова, а также соственных экспериментальных данных М. Е.

Лобашевсформулировал физиологическую гипотезу мутационного процесса. Изучая механизмыприспособления организма к факторам среды, Д. Н. Насонов и В. Я. Александровустановили, что при воздействии повреждающими агентами в клетках растений иживотных наблюдаются закономерные обратимые изменения, которые приводят кувеличению сорбционных свойств тканей в отношении некоторых красителей.

[36].Авторы этой работы сделали вывод о том, что различные по своей природе воздействия14вызывают в клетке однотипную неспецифическую реакцию с характерным комплексомизменений, и предположили, что в основе обратимых изменений лежит обратимаяденатурация белков цитоплазмы [36]. М. Е. Лобашев предположил, что изменениеколичествакрасителя,адсорбированноготканью,служитпоказателемстепениповреждения клеток и позволяет оценивать чувствительность клеток разных организмов кразличным воздействиям.

Это предположение было проверено Михаилом Ефимовичем вэкспериментах по воздействию высокой температурой на лягушек и мышей, которыхпредварительно содержали при разных температурных режимах [33]. На основе этихисследований был сделан вывод о том, что изменение некоторых свойств живоговещества клетки происходит при перемене условий и при этом смещается порогповреждений, который может сохраняться некоторое время после изменения внешнихусловий [33].

М. Е. Лобашевым были проведены дополнительные эксперименты поокраске нейтральротом половых клеток дрозофилы при воздействии на них высокойтемпературой и рентгеновским облучением. Было показано, что эти воздействия приводятк обратимому увеличению сорбционных свойств цитоплазмы половых клеток, авосстановление клетки к исходному состоянию зависит от глубины воздействия иусловий, при которых оно происходит. Изменение сорбционных свойств цитоплазмыможно рассматривать как косвенный показатель временных изменений в клетке [33].