Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 8

Б). Гибриды, образовавшиеся в результате этого события,теряют способность к дальнейшему спариванию, так как содержат оба варианта локусаМАТ – МАТа и МАТα. Система "незаконной" гибридизации позволяет также учитыватьконверсию генетической информации из кассеты HMRa в локус МАТα (рисунок 7. А).Кроме того, в системе "незаконной" гибридизации можно учитывать суммарную частотусобытий: генных мутаций, произошедших в двустороннем промоторе локуса МАТα илиодновременно в MATα1 и MATα2, одиночных мутаций в MATα1 или MATα2, и первичныхповреждений, которые были устранены белками репарации и не привели к возникновениюнаследуемыхизмененийгенетическогоматериала(рисунок7.Д).Гибриды,образовавшиеся в результате этих генетических событий, имеют одинаковый фенотип(таблица 2), поэтому различить генные мутации и первичные повреждения в системе"незаконной" гибридизации невозможно.37Для того чтобы выявить и определить долю первичных повреждений, устраненныхсистемами репарации безошибочно, необходимо проводить альфа-тест в варианте"незаконной" цитодукции.

Цитодукция – это результат нарушенной гибридизации клеток,при которой происходит объединение цитоплазмы, но не происходит слияние ядер иобразование диплоидов. В ходе цитодукции процесс формирования зиготы происходитнормально только до момента слияния клеток, дальше происходит формированиемногоядерной зиготы, которая при последующих делениях может дать началогетерокарионам и гаплоидным клеткам со смешанной цитоплазмой [126-128]. Частотаспонтанного образования законных цитодуктантов составляет менее 1%, для ееповышения используют мутации, которые препятствуют кариогамии, в частности kar1-1,наличие которой повышает частоту возникновения цитодуктантов до 95% [127, 128].Открытие явления, нарушающего кариогамию [126, 129], положило начало разработкеметода селективной системы цитодукции [130]. В селективной системе цитодукции такжеиспользуют два штамма.

Один из штаммов является донором цитоплазмы и несетнормально функционирующие митохондрии, другой штамм – реципиент цитоплазмыобладает дыхательной некомпетентностью [ρ-], которая компенсируется за счетмитохондрий донорного штамма после скрещивания клеток (рисунок 8. Б). Штаммреципиент цитоплазмы должен нести рецессивный маркер устойчивости к антибиотику(например, к циклогексимиду – cyhr) и мутацию kar1-1, блокирующую кариогамию вкопулирующихклетках.Благодаряметодуселективнойсистемы"незаконной"цитодукции появляется возможность клонирования непосредственно гаплоидного ядрареципиента цитоплазмы, которое подверглось изучаемому воздействию и несловременное или мутационное изменение.38Рисунок 8.

Схема проведения тестов на "незаконную" гибридизацию (А) и "незаконную"цитодукцию (Б).Различать временные или наследуемые изменения в локусе МАТα можнопосредством анализа типа спаривания отобранных цитодуктантов [14, 81, 82].Цитодуктанты, отобранные в альфа-тесте, могут иметь: тип спаривания α, рецессивныйтип спаривания а (а*), нормальный тип спаривания а или являться стерильными (n/m).При полном устранении первичных повреждений образовавшиеся цитодуктантывосстанавливают тип спаривания исходной клетки (α); если повреждение в одном из геновлокуса МАТα устраняется безошибочно, а во втором превращается в мутацию,цитодуктанты теряют способность к спариванию (n/m); если оба повреждения в двухгенах локуса МАТα или одно повреждение в двустороннем промоторе закрепились в видемутаций образовавшиеся цитодуктанты приобретают тип спаривания рецессивный а (а*)(рисунок 9). Система "незаконной" цитодукции позволяет также выявлять конверсиюгенетического материала из кассеты HMRa в локус MATα (фенотип цитодуктантов – а)(рисунок 9) (таблица 2).

В системе "незаконной" цитодукции невозможно учитыватьчастоту потерь хромосомы III, ее плеча и рекомбинацию, поскольку такие событиялетальны для гаплоидных клеток. Большинство цитодуктантов (до 90%), отбираемых вальфа-тесте, имеют тип спаривания α. Они появляются в результате фенотипическогопроявления первичного повреждения, временно нарушившего экспрессию локуса МАТα и39приведшего к переключению типа спаривания α → а.

После спаривания с другой клеткойα типа спаривания повреждение устраняется бесследно, а клетка восстанавливаетпервоначальный фенотип α.Поскольку все учитываемые в альфа-тесте изменения рецессивны, в тестах на"незаконную" цитодукцию и гибридизацию для снижения вероятности переключениятипа спаривания у штамма-донора цитоплазмы, в качестве партнера для скрещиванияобычно используют автодиплоидные штаммы дрожжей, гомозиготные по MATα.Рисунок 9. Классы "незаконных" цитодуктантов, учитываемы в альфа-тестеСиним кружком отмечены временные (первичные) повреждения локуса MATα, краснымкружком генные мутации, которые являются результатом превращения первичныхповреждений в ходе нетождественной репарации в наследуемые изменения генетическогоматериала. Фенотип а, отмеченный голубым цветом, обозначает временный характерпереключения типа спаривания клетки α → а, произошедшего в результате появленияпервичных повреждений в локусе MATα.Учитываемые в альфа-тесте генные мутации, перестройки и потери хромосомы IIIявляются следствием возникновения в геноме первичных повреждений ДНК, таких какмодификации оснований, однонитевые и двунитевые разрывы ДНК, накопление которыхзапускает процессы репарации.

Эти повреждения способствуют мутационному процессу,40приводякподстановкеДНК-полимеразойнеправильногонуклеотиданапротивповреждения, что приводит к появлению мутаций или рекомбинационным изменениям взависимости от типа повреждения. Таким образом, частота "незаконной" гибридизации ицитодукции отражает общую частоту первичных повреждений ДНК в локусе МАТα, аанализ фенотипа "незаконных" гибридов и цитодуктантов позволяют количественнооценить долю тех первичных повреждений ДНК, которые были устранены безошибочно,но за время своего существования в клетке успели повлиять на ее фенотип (привести квременному переключению типа спаривания α → а), а также долю тех первичныхповреждений, которые закрепились в виде мутаций или привели к потере хромосомы III иее правого плеча, а также индуцировали генную конверсию и рекомбинацию (таблица 2).Именно возможность фиксации фенотипического проявления первичных поврежденийДНК до их устранения системами репарации (класс цитодуктантов, сохранивших типспаривания α) делает альфа-тест удобной моделью для изучения процесса возникновенияпервичных повреждений, временных параметров их существования, а также механизмоввзаимопревращения и устранения первичных повреждений системами репарации.411.6.

Постановка задачиФормирование современных представлений о мутагенезе как о сложном процессе,неразрывно связанном с условиями среды и контролируемом многими эндогеннымифакторами, имеет длительную историю и продолжает свое развитие. Переломныммоментомсталовыявлениесвязимеждускоростьюмутагенезаитакимивнутриклеточными процессами, как репарация, репликация и рекомбинация, общимэтапом которых является матричный синтез ДНК. Эти идеи были широко воспринятылишь в 60-е гг.

XX века после появления первых экспериментальных данных омолекулярных основах наследственности и изменчивости. Впервые же термины"мутация" и "репарация" прозвучали совместно в работах Михаила Ефимовича Лобашевас соавторами в 30-е – 40-е годы прошлого века, задолго до открытия структурыгенетического материала. Физиологическая теория мутационного процесса, предложеннаяМихаилом Ефимовичем, предполагает, что всем или абсолютному большинствунаследуемыхизмененийгенетическогоматериалапредшествуютпервичные(предмутационные) изменения генов, которые в результате репарации могут либозакрепляться в виде мутаций, либо устраняться бесследно. Эта теория уже не вызываетникаких сомнений, поскольку получила широкое экспериментальное подтверждение вомножестве работ. Наше исследование направлено на изучение ряда вопросов, являющихсяследствием физиологической теории мутационного процесса.Первичные повреждения генетического материала, в ходе нетождественнойрепарации, часто приводят к возникновению хромосомных перестроек и генных мутаций,которые являются причиной развития наследственных и онкологических заболеваний учеловека.

Далеко не все первичные повреждения превращаются в наследуемые изменения,большуюихчастьустраняютсистемырепарациибезошибочно.Отмоментавозникновения до устранения первичного повреждения может проходить длительноевремя. Например, процесс устранения двунитевых разрывов у дрожжей S. cerevisiae можетзанимать от 2 до 8 часов, что соответствует продолжительности 1 – 4 клеточных циклов воптимальных условиях [131]. Мы полагаем, что различные повреждения за время своегосуществования в ДНК в разной мере нарушают транскрипцию и репликацию и такимобразом влияют на реализацию генетической информации. Такая возможность былапоказана в нескольких работах [45, 52, 54-56], однако механизм и детали этого процессапрактически не изучены.

Выявление молекулярной природы и временных параметровсуществования и устранения первичных повреждений имеет фундаментальное значениедля поиска общих механизмов наследственной и модификационной изменчивости.42Изучение механизмов фенотипического проявления первичных поврежденийсопряжено с объективными трудностями. Из-за временного характера первичныхповреждений их фенотипическое проявление невозможно зарегистрировать при помощибольшинства известных тест-систем, используемых в генетической токсикологии.Поэтому часто исследователи вынуждены использовать такие тесты, в которых ведут учетконечных результатов репарации – генных и хромосомных мутаций и рекомбинации.