Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 9

Внастоящее время разработаны подходы, позволяющие с помощью физических методоввыявлять количество первичных повреждений определенных типов на уровне отдельныхклеток in vitro. Подобные тесты не могут быть использованы для изучения начальныхэтапов возникновения мутаций, а именно способности первичных повреждений влиять нафенотип клеток еще до устранения системами репарации. Уникальным в этом отношенииявляется альфа-тест.

Альфа-тест позволяет определять не только частоту наследуемыхизменений, но и выявлять первичные повреждения по их фенотипическому проявлению –временному переключению типа спаривания дрожжевых клеток α → а. Другое важноедостоинство альфа-теста состоит в том, что с его помощью можно прослеживатьдлительность существования первичных повреждений и скорость их устранениясистемами репарации относительно стадий клеточного цикла.Разные по своей химической структуре первичные повреждения генетическогоматериала являются субстратом различных систем репарации.

Эффективность устраненияпервичныхповрежденийпосредствомрепарациизависитоттипапервичногоповреждения и стадии клеточного цикла, на которой возникло это повреждение [132].Начальные этапы становления мутаций исследованы очень слабо. В частности, ничего неизвестно о том, могут ли первичные повреждения различных типов сохраняться в геномена протяжении нескольких стадий клеточного цикла или даже нескольких клеточныхделений и какое влияние они оказывают на экспрессию генетической информации. Мыожидаем, что исследование эффекта эталонных мутагенов и генетических блоков системрепарации позволит нам определить типы первичных повреждений, способныхпроявляться фенотипически, а также исследовать временные параметры проявленияпервичных повреждений относительно стадий клеточного цикла.43Глава 2.

Материалы и методы2.1. Штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, использованные в работеШтаммы дрожжей S.cerevisiae, использованные в работе, перечислены в таблице №3.Таблица№3.ГенотипыштаммовдрожжейSaccharomycescerevisiae,использованных в работеШтаммK5-35BД924K5-35BД924 kar1-1ГенотипПрименениеMATα ura3Δ leu2ΔБазовый тестерный штамм вmet15Δ lys5::KanMXсистеме "незаконной"cyhrгибридизацииMATα ura3Δ leu2ΔБазовый тестерный штамм вmet15Δ lys5::KanMXсистеме "незаконной"cyhr kar1-1 [rho-]цитодукцииИсточник[16]MATα//MATαADE1//ade1Δleu2//leu2Д926lys2//lys2ura3//ura3 his4//Партнер для скрещивания(донор цитоплазмы)his4 thr4//thr4CYHs [rho+ ]K5-35BД924-ogg1K5-35BД924 ogg1kar1-1MATα ura3Δ leu2ΔТестерный штамм в системеПолучен вmet15Δ lys5::KanMX"незаконной" гибридизации сданной работеcyhr ogg1Δ::URA3мутацией ogg1MATα ura3Δ leu2Δmet15Δ lys5::KanMXcyhr ogg1Δ::URA3-kar1-1 [rho ]Тестерный штамм в системе"незаконной" цитодукции смутацией ogg1Получен вданной работеK5-35B-MATα ura3Δ leu2ΔТестерный штамм в системеПолучен вД924- pms1met15Δ lys5::KanMX"незаконной" гибридизации сданной работе44cyhr pms1Δ::LEU2K5-35BД924 pms1kar1-1MATα ura3Δ leu2Δmet15Δ lys5::KanMXcyhr pms1Δ::LEU2kar1-1 [rho-]мутацией pms1Тестерный штамм в системе"незаконной" цитодукции сданной работмутацией pms1K5-35B-MATα ura3Δ leu2ΔТестерный штамм в системеД924-met15Δ lys5::KanMX"незаконной" гибридизации сcdc28-4cyhr cdc28-4мутацией cdc28-4K5-35BД924 cdc284-kar1-1MATα ura3Δ leu2Δmet15Δ lys5::KanMXrcyh cdc28-4 kar1-1[rho-]МАТα CEN3::pGal1-K5-35B-CEN3-URA3 ura3ΔД924-cen3leu2Δ met15Δ lys5::KanMX cyhr78А-П2345MATα his52Г-П2345MATa his5Получен вТестерный штамм в системе"незаконной" цитодукции сПолучен вданной работеПолучен вданной работемутацией cdc28-4Тестерный штамм в системе"незаконной" гибридизации совстроенным в центромерухромосомы III индуцируемымПолучен вданной работепромотором GAL1Тестеры типа спариванияПетергофскаягенетическаяИдентификация2A-P143MATα ura3 ade8коллекция [133]цитодуктантов типаспаривания а*2.2.

ПлазмидыПлазмиду pPM867 [134] использовали для внесения дизрупции гена OGG1 вбазовые тестерные штаммы, применяемые в системах "незаконной" гибридизации ицитодукции, K5-35B-Д924 и K5-35B-Д924-kar1-1.ПлазмидуPAM58,сконструированнуюМоррисономссоавторами[135],использовали для внесения дизрупции гена PMS1 в штаммы K5-35B-Д924 и K5-35B-Д924kar1-1. Плазмиды pPM867 и PAM58 были любезно предоставленные д.б.н.

Ю. И.Павловым (Университет штата Небраска, США).45Плазмида pCEN-UG была использована для встраивания индуцируемого промотерагена GAL1 в центромеру хромосомы III CEN3::pGal1-CEN3-URA3 в штаммы K5-35B-Д924и K5-35B-Д924-kar1-1. Плазмида pCEN-UG была любезно предоставлена профессоромРобертом Рейдом (Медицинский центр Колумбийского университета, США) [136].ИнтегративнуюплазмидуpTB1применялидлявнесениятемпературно-чувствительной мутации cdc28-4 в базовые штаммы K5-35B-Д924 и K5-35B-Д924-kar1-1.Плазмида pTB1 содержит фрагмент аллели cdc28-4 с нуклеотидными заменами C382T иС384T, которые приводят к аминокислотной замене H128Y в соответствующем белке[137, 138].

Плазмида pTB1 была нам любезно предоставлена профессором ЭдвардомВинтером (Университет Томаса Джефферсона, США) [138].2.3. Среды и условия культивированияДрожжи выращивали на полных средах: жидкой и твердой среде YEPD [133, 139] иминимальной среде MD (минимальная дрожжевая среда по рецепту Yeast Nitrogen Base),содержащейнеобходимыеаминокислоты,азотистыеоснования,витаминыимикроэлементы. Аминокислоты и азотистые основания добавляли в среду в следующихконцентрациях: L-гистидин, урацил и L-метионин – 20 мг/л, L-лизин – 30 мг/л, L-треонин– 150 мг/л, L-лейцин – 60 мг/л. В работе использовали аминокислоты и азотистыеоснования фирм Sigma и Helicon. Для приготовления твердых сред использовали агарфирм Sigma или Difco в конечной концентрации 20 г/л.Дрожжи выращивали при температуре 30ºС.

При использовании температурночувствительных мутантов cdc28-4 культуры выращивали при температуре 22ºС или 37ºС.Среду для отбора "незаконных" гибридов готовили на основе среды MD сдобавлениемурацила,L-лейцина,L-треонинаиL-гистидинавстандартныхконцентрациях.Среду для отбора "незаконных" цитодуктантов готовили на основе среды MD безглюкозы с добавлением этилового спирта – 20 мл/л, антибиотика циклогексимида – 5 мг/л,необходимых для роста штамма-реципиента цитоплазмы добавок: L-лейцина, Lметионина, L-лизина и урацила в стандартных концентрациях.Для отбора канаванин-устойчивых клонов готовили среду на основе среды MD сдобавлением всех необходимых для роста ауксотрофного штамма аминокислот иазотистыхоснованийконцентрации 40 мг/л.встандартныхконцентрациях,атакжеL-канаванинав46Для получения дыхательно некомпетентных штаммов [ρ-] дрожжи растили натвердой среде YEPD с добавлением бромистого этидия в концентрации 60 мг/л.Дыхательную компетентность дрожжевых штаммов определяли по их способности растина среде СПГ, которая отличается от YEPD тем, что вместо глюкозы содержит глицерин вкачестве источника углерода в концентрации 24 мл/л.2.4.

РеактивыВ работе использовали аминокислоты и азотистые основания фирм "Sigma" и"Helicon", камптотецин, L-канаванин, диметилсульфоксид (ДМСО), циклогексимид,альфа-фактор, гидроксимочевину, нокодазол фирмы "Sigma", 5-фтороротовую кислоту(ФОА) фирмы "Fermentas", эндонуклеазы рестрикции и соответствующие буферы фирм"Fermentas" и "New England Biolabs".2.5. Стандартные методы генетики дрожжейВ работе были использованы следующие стандартные методы частной генетикидрожжей: методы скрещивания и отбора гибридов, метод селективных сред для анализаауксотрофности, метод получения индивидуальных клонов при посеве истощающимштрихом, метод серийных разведений, метод отпечатков [140, 141].

Тип спариваниядрожжевых штаммов определяли по их способности образовывать гибриды с тестернымиштаммами 78А-П2345 и 2Г-П2345.2.6. Молекулярно-генетические методыТрансформация клеток дрожжейТрансформациюдрожжейпроводилипостандартнойметодике[139]смодификациями. Ночную культуру дрожжей разводили в 4 раза в среде YEPD сдобавлением аденина в конечной концентрации 100 мг/мл и растили 2-4 часа. Для каждойреакции трансформации отбирали по 1,5 мл культуры дрожжей. Клетки осаждалицентрифугированием в течение 5 минут при 3000 об/мин. К осадку добавляли 500 мклPEG-TE-LiAc (40% ПЭГ-4000, 10 мM Tris-HCl (pH 8,0), 1 мM ЭДТА 0,1 M LiAc), 7 мклДНК-носителя(денатурированнаяДНКтимусателенка,10мг/мл),2мклтрансформирующей ДНК (0,1-1 мкг) и 56 мкл ДМСО.

Полученную смесь инкубировали15 минут при комнатной температуре с постоянным перемешиванием, после чего клеткиподвергали тепловому шоку на водяной бане при 42°С в течение 15 минут. Клеткиосаждали центрифугированием 5 минут при 3000 об/мин. и высевали на селективную47среду для отбора трансформантов. Выросших трансформантов клонировали населективной среде и проверяли методом отпечатков на серии селективных сред.Сайт-специфический гидролиз ДНКРеакцию рестрикции осуществляли в соответствие с рекомендациями фирмпроизводителей ферментов.