Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 10

Применяли эндонуклеазы рестрикции Acc65-I и SalI длягидролиза плазмиды pPM867, эндонуклеазы рестрикции MluI и ApaI для гидролизаплазмиды PAM58, HotI для обработки плазмиды pCEN-UG, XhoI для линеаризацииплазмиды pTB1.В ходе исследований были использованы вспомогательные молекулярногенетическиеметоды: гель-электрофорезДНК, трансформация клеток бактерий,выделение плазмидной ДНК из E. coli, которые проводили по стандартным протоколам[142].2.7. Обработка клеток эталонными мутагенамиНезависимые культуры клеток дрожжей тесторного штамма обрабатывали ГАП вовремя роста культуры.

Для этого дрожжи выращивали в течение 16 ч в жидкой средеYEPD, содержащей ГАП в концентрации 50 мг/л. Затем клетки, обработанные такимобразом, использовали в тестах на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию.Обработку клеток камтотецином производили на твердой среде. Ночную культуруклеток тестерного штамма высевали на среду YEPD, содержащую камптотецин вконцентрации 7 мг/л.Облучение клеток тестерного штамма ультрафиолетовым светом с длиной волны264 нм проводили на твердой селективной и полной средах. Источником излученияслужили две параллельно расположенные лампы ДБ30 с мощностью излучения 4 Дж·с/м2.Доза облучения составляла 17 Дж/м2 или 31 Дж/м2 в зависимости от длительностиобработки.2.8. ФотореактивацияДляиндукциифотореактивацииклеткитестерногоштаммаоблучалиультрафиолетовым излучением с длиной волны 365 нм в дозе 36000 Дж/м2.

В качествеисточника облучения служили две параллельно расположенные лампы VL-330BL фирмыVilber с мощностью излучения 10 Дж·с/м2.482.9. Тесты на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию6-12 независимых культур тестерного штамма растили в жидкой среде YEPD втечение 16 часов при 30°С на качалке. Клетки с мутацией cdc28-4 выращивали 48 часовпри 22°С в жидкой среде YEPD на качалке.

При тех же условиях растили культуруштамма Д926, используемого в качестве партнера для скрещивания в альфа-тесте.Обработку мутагенами осуществляли согласно п. 2.7.В тесте на "незаконную" гибридизацию по 50 или 100 мкл суспензии клеток обоихштаммов высевали на селективную среду для отбора "незаконных" гибридов. Приизучении действия камптотецина (см. п.

2.7) обработку мутагеном проводили на твердойсреде, поэтому клетки обоих штаммов высевали на среду YEPD и среду YEPD скамптотецином, чашки инкубировали 24 час, после чего клетки перепечатывали населективную среду для отбора "незаконных" гибридов. В тесте на "незаконную"цитодукцию выросшие в жидкой среде клетки концентрировали в десять раз доконцентрации 109 кл/мл.

По 100 мкл суспензии клеток тестерного штамма и партнера дляскрещивания высевали на твердую среду YEPD и инкубировали совместно 48 часов,после чего клетки перепечатывали на среду для отбора "незаконных" цитодуктантов.Параллельно подходящие разведения клеток тестерного штамма высевали на средуYEPD для оценки выживаемости.2.10. Определение общей частоты "незаконной" гибридизации и цитодукции.Общую частоту "незаконной" гибридизации или цитодукции в каждом случаевычисляли по формулеF(M  a)  d,( N  b)  cгде М – число колоний, выросших на среде для отбора "незаконных" гибридов илицитодуктантов, N – число колоний, выросших на полной среде, a и b – соответствующиефакторы разведения, с – объём культуры тестерного штамма, высеянный на селективнуюсреду для отбора "незаконных" гибридов или цитодуктантов, d - объём культурытестерного штамма, высеянный на полную среду для оценки выживаемости.При определении частот "незаконной" гибридизации или цитодукции использовали6-12 независимых культур тестерного штамма.

Каждый эксперимент повторяли не менеетрех раз.492.11. Определение типа спаривания "незаконных" гибридов и цитодуктантовОтобранных "незаконных" гибридов распределяли по классам в соответствии с ихтипом спаривания и наличием ауксотрофностей по гистидину и треонину (Таблица 1.5.1).Отобранные "незаконные" гибриды скрещивали с тестерными штаммами а и α типовспаривания, ауксотрофными по гистидину (2Г-П2345 и 78А-П2345).

По способности"незаконных" гибридов скрещиваться с тестерными штаммами определяли типспаривания α или некопулирующий (n/m) (рисунок 10 А). Долю гибридов каждого классаопределяли как отношение числа гибридов данного класса к общему числу проверенных"незаконных" гибридов.

Частоту гибридов каждого класса определяли перемножениемобщей частоты "незаконной" гибридизации на долю данного класса."Незаконных" цитодуктантов также распределяли по классам в соответствии с ихтипом спаривания. Отобранных цитодуктантов скрещивали с тестерными штаммами а и αтипов спаривания, ауксотрофными по гистидину (2Г-П2345 и 78А-П2345). Поспособности цитодуктантов образовывать гибриды с тестерными штаммами определялитип спаривания цитодуктантов а, α или некопулирующий (n/m).

Класс цитодуктантов,имеющих а тип спаривания гетерогенен и включает в себя как цитодуктантов, у которыхпроизошло истинное переключение типа спаривания α → а (например, за счетперемещения кассеты) так и цитодуктантов, обладающих Alf-фенотипом, которыйпроявляется как рецессивный тип спаривания а (a*). Для определения Alf-фенотипацитодуктантов а типа спаривания скрещивали со штаммом 2A-P143. Затем проверяли типспаривания полученных гибридов по их способности скрещиваться с тестернымиштаммами 2Г-П2345 и 78А-П2345. Если гибрид от скрещивания цитодуктанта а типаспаривания и штамма 2A-P143 сохранял способность скрещиваться с тестерным штаммома типа спаривания, то цитодуктант, от которого был получен данный гибрид, имел типспаривания рецессивный а (а*).

В том случае, когда гибриды исследуемого цитодуктантаи штамма 2A-P143 теряли способность скрещиваться с тестерными штаммами обоих (а иα) типов спаривания, исходного цитодуктанта относили к классу цитодуктантов,имеющих истинный тип спаривания а (рисунок 10 Б). Долю классов цитодуктантовопределяли как отношение числа цитодуктантов каждого класса (а, α, n/m и а*) к общемучислу проверенных цитодуктантов. Частоту каждого класса цитодуктантов определяликак произведение доли класса на общую частоту "незаконной" цитодукции.50Рисунок 10. Схема определения типа спаривания: А. у отобранных "незаконных"гибридов или цитодуктантов Б.

определение фенотипа рецессивный а (а*) средицитодуктантов а типа спаривания.2.12. Количественный тест на индукцию прямых мутаций устойчивости кканаванинуДляпроведениятестадрожжевыеклетки,предварительнообработанныемутагенами (см п.2.7) или имеющих мутации, блокирующие различные системырепарации, высевали на среду MD, содержащую все необходимые добавки для росташтаммов и токсичный аналог аргинина – аминокислоту L-канаванин в концентрации 40мг/л.

Для подсчета выживаемости клетки высевали на среду YEPD в разведениях,позволяющих вести подсчет колоний. Частоту встречаемости канаванин-устойчивыхмутантов вычисляли как соотношение числа выросших мутантов к общему числувысеянных клеток (по формуле из п. 2.10).2.13. Процедура синхронизации дрожжевых клеток перед проведением проточнойцитометрииДлясинхронизациииспользовалимутациюдрожжевыхcdc28-4.штаммов,Дрожжевые7применяемыхкультурыввыращивалиальфа-тесте,дораннейлогарифмической стадии роста 0,2–0,5 × 10 клеток/мл в жидкой среде YEPD при51температуре 22ºС.

Ночную культуру клеток разводили в 10 раз свежей жидкой средойYEPD и растили еще 4 часа при температуре 22ºС. Затем дрожжевые культурыпереносили в 37°C и инкубировали 2-4 часа. Для определения числа клеточных циклов, втечении которых сохраняется синхронизация, дрожжевые клетки охлаждали до 22ºС ирастили при этой температуре еще 2-4 часа.2.14. Подготовка образцов для проточной цитометрииДля проточной цитометрии использовали 1 мл суспензии, содержащей (0,5-1 × 107кл/мл), подготовленных согласно п.

2.13. Клетки, отобранные в различные промежуткивремени после обработки синхронизирующим агентом собирали центрифугированием1500 g в течение 3 минут, промывали в том же объеме стерильной воды. Для фиксацииклеток к ним приливали 1 мл 70% этанола, перемешивали и инкубировали 1 час прикомнатной температуре или ночь при 4°C. Затем клетки отмывали стерильной водой, дляэтого образцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 секунд, осадокресуспендировалив0,7-1млводы,затемсновацентрифугировали.Осадокресуспендировали в 0,5-0,7 мл раствора рибонуклеазы А (РНКазы) (2мг/мл РНКазы в 50мM Tris pH 8,0) и инкубировали в течение 6-15 часов при температуре 37°C. Наследующий день к суспензии дрожжевых клеток добавляли 30-50 мкл растворапротеиназы K (20 мг/мл) и инкубировали 1 час при температуре 50°C.

Клетки собралицентрифугированием (10000 об/мин 5 секунд) и ресуспендировали в 0,5 мл 50 мM This, pH7 (образцы, подготовленные таким образом, можно хранить при температуре 4°Cнесколько дней). Далее 50 мкл суспензии клеток добавляли в 1 мл раствора сфлуоресцентным красителем SYBR GREEN I [143]. Краситель SYBR GREEN I разводили10000 раз в растворе 50 мM Tris, pH 7,5. Полученные образцы обрабатывали ультразвукомпри низкой мощности и инкубировали при температуре 4 °C в темноте 10 минут, а затеманализировали на приборе FACSCalibur или BD accuri C6.2.15.

Микроскопия с флуоресцентной окраской DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)Окраску живых дрожжевых клеток проводили c использованием реагентаVectashield Mounting Medium with DAPI согласно протоколу производителя VectorLaboratories. Для этого 10 мкл суспензии живых дрожжевых клеток и 5 мкл красителясмешивали на предметом стекле и накрывали покровным стеклом.Флюоресцентный анализ образцов проводили на микроскопе Leica DM 6000B"Leica Microsystems GmBH" с использованием системы анализа Leica QWin Standart52V3.2.0. Флюоресценцию анализировали, используя компонет "А" с запирающим фильтром425 нм и возбуждающим фильтром 340 нм.2.16. Статистические методыПри определении частот "незаконной" гибридизации и цитодукции, частотывозникновения прямых мутаций устойчивости к канаванину использовали стандартныеметоды вычисления медиан и оценки доверительных интервалов для медиан [144-146].Достоверность различий между значениями частот спонтанных и индуцированных приразличных воздействиях в тестах на "незаконную" гибридизацию, цитодукцию илипрямых мутаций устойчивости к канаванину определяли с помощью непараметрическихкритериев Манна-Уитни в случае 2-х независимых выборок, Краскела-Уолиса в случае kнезависимых выборок, Вилкоксона в случае 2-х зависимых выборок и Фридмана в случаеk зависимых выборок, при уровне значимости P=0,05 [144].

При отсутствии различиймежду выборками из разных экспериментов, значения объединяли в новую выборку, длякоторой рассчитывали медиану и доверительный интервал.Стандартную ошибку доли классов гибридов или цитодуктантов определялиследующим методом [144, 145, 147]. При значении доли класса от 0,2 до 0,8 ошибку долиопределяли с использованием следующих формул:стандартная ошибка доли S p(1  p),nгде p – доля - количество гибридов или цитодуктанов определенного класса, n –общее число проверенных цитодуктантов.Полученное значение S использовали для вычисления доверительного интервалаp :p  t( p, f )  S ,где t( p , f ) – t критерий Стьюдента при уровне значимости P=0,05 и числе степенейсвободы f  n  1 .Значение доли гибридов или цитодуктантов каждого класса представляли в виде:M  p  p .При значении доли ≤0,2 или ≥0,8 стандартную ошибку доли вычисляли последующей формуле:53ln S ln p ln(1  p),nдоверительный интервал рассчитывали по формуле:ln M  ln p  t( p, f ) ln S .Получали значения M, вычисляя экспоненту, и рассчитывали p .Достоверность отличий между сравниваемыми долями классов гибридов илицитодуктантов оценивали с помощью z критерия с поправкой на непрерывность [144,145].54Глава 3.