Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae), страница 2
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae". PDF-файл из архива "Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Живые организмы постоянно испытывают разнообразныевоздействия генетически активных факторов, которые нарушают стабильность генома [1].Изменение темпов мутирования под действием экзогенных и эндогенных факторов можетсущественно отразиться на численности и генетической структуре популяции, а такжездоровье человека и приспособленности растений и животных к условиям обитания.Дестабилизация генетического материала является причиной возникновения многихнаследственных и онкологических заболеваний человека, а также приводит к снижениюжизнеспособности организмов и ускоряет процесс старения клеток [2-5]. Современныепредставления о причинах возникновения и механизмах становления наследуемыхизмененийгенетическогоматериалаформировалисьнапротяжениинесколькихдесятилетий XX века. Их во многом предвосхитили идеи, высказанные в теорииконвариантнойредупликацииН.В.Тимофеева-Ресовского,описывающейсамовоспроизведение генетического материала на основе матричного синтеза свозможностью передачи последующим поколениям отклонений от исходного состояния(наследуемых изменений), а также в физиологической теории мутационного процессаМ.Е.Лобашёва, в которой впервые было сделано предположение о существованиипредмутационных повреждений генетического материала.
Эти две теории во многомпредопределили направление развития дальнейших исследований. Многие теоретическиеположения, высказанные Н. В. Тимофеевым-Ресовским и М. Е. Лобашевым, позжеполучили экспериментальное подтверждение в работах, посвященных изучениюмолекулярных механизмов репликации, репарации и рекомбинации генетическогоматериала. В настоящее время общепринятым является представление о том, что мутациивозникают в ходе многоступенчатого процесса, который занимает длительное время, а воснове мутагенеза лежит неоднозначность матричных процессов.Согласно современным представлениям в основе абсолютного большинстванаследуемых изменений генетического материала лежат первичные повреждения ДНК,такие как одно- и двунитевые разрывы ДНК, модификации оснований, пиримидиновыедимеры, 6-4 фотопродукты, аддукты, разрывы сахаро-фосфатного остова молекулы ДНК[4, 6]. Процесс устранения первичных повреждений ДНК включает несколько этапов иможет занимать длительное время.
В результате репарации поврежденной ДНКпервичные повреждения либо бесследно устраняются, либо превращаются в генныемутации и хромосомные перестройки, или индуцируют реципрокную рекомбинацию, чтоприводит к изменению фенотипических признаков организма [4]. Влияние наследуемых7изменений генетического материала на фенотип организмов изучено достаточно хорошо,но данные о характере и механизмах фенотипического проявления первичныхповреждений ДНК ещё до момента их превращения в мутации или устранения системамирепарации практически отсутствуют. Для решения этой актуальной задачи мы предлагаемиспользовать подход, разработанный на кафедре генетики и биотехнологии СанктПетербургского государственного университета, который получил название альфа-тест.Альфа-тест позволяет выявлять широкий спектр изменений генетического материала:первичные повреждения ДНК, генные мутации, рекомбинационные события и потерихромосом.Использованиеэтогометодапозволитвыявитьприродупервичныхповреждений, способных проявляться фенотипически, а также проследить их судьбупосле репарации.Степень разработанности темы.
Изучение генетических событий, лежащих воснове развития наследственных и онкологических заболеваний, является актуальнойпроблемой. Хорошо изучены последствия накопления генных и геномных мутаций вканцерогенезе, выявлены мутантные аллели некоторых генов, которые тесно связаны сриском развития наследственных и онкологических заболеваний [4, 7-11]. Тем не менее,первые этапы становления генных и геномных мутаций, а именно: механизмывозникновения и взаимопревращения первичных повреждений ДНК, а также временныепараметры и эффективность их устранения системами репарации – требуют дальнейшегоболее глубокого изучения.
В настоящее время разработано много методов длярегистрации генных и геномных мутаций различных типов [12], но из-за вр менногохарактера первичных повреждений эти методы не позволяют прослеживать весь процесспревращения первичных повреждений ДНК в наследуемые изменения генетическогоматериала, а также сопоставлять фенотипическое проявление первичных повреждений инаследуемых изменений генетического материала. Так, например, метод ДНК-комет,являющийся одним из наиболее широко применяемых методов для исследованияповреждений ДНК, позволяет судить только о количестве разрывов ДНК и некоторыхдругих повреждений в клетке [13], но не позволяет сделать какие-либо выводы о влиянииразрывов ДНК в определенных генах на экспрессию этого гена или о судьбе первичныхповреждений после репарации ДНК с этими повреждениями.
Альфа-тест – единственнаяизизвестныхсистем,позволяющаярегистрироватьфенотипическоепроявлениепервичных повреждений ДНК и отличать его от проявления наследуемых измененийгенетическогоматериала.Кнастоящемувремениполученоэкспериментальноеподтверждение принципиальной возможности создания альфа-теста, а также разработаны8методики для изучения эффективности данной тест-системы [14-16]. Продемонстрированаэффективность альфа-теста для выявления генетически активных факторов окружающейсреды. В альфа-тесте был протестирован целый ряд физических и химических мутагенов:ультрафиолетовое излучение, этилметансульфонат, аналоги оснований (6-гидроксиламинопурин, 8-оксигуанин), 2-аминофлуорен, β-пропиолактон и ICR-170, акрилонитрил,диэтилгексилфтолатидиэтилстильбестрол[16,17].Альфа-тестпоказалсвоюэффективность для изучения результата инактивации ряда генов системы синтеза ДНК вобход повреждений и репарации ДНК с двунитевыми разрывами [17].
При определениигенетической активности 10 известных канцерогенов, мутагенный эффект которых не былпоказан, альфа-тест оказался наиболее чувствительным по сравнению с классическимитестами на конверсию, митотическую рекомбинацию и обратные мутации [18]. Данные,полученные нами ранее, подтверждают, что альфа-тест является адекватным подходомдля регистрации фенотипического проявления первичных повреждений ДНК инаследуемых изменений генетического материала, возникающих как спонтанно, так и привоздействии различными мутагенами.Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы: изучить характерфенотипического проявления первичных повреждений генетического материала и ихвклада в наследственную и модификационную изменчивость у дрожжей Saccharomycescerevisiae с использованием альфа-теста.Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:1.
Оценить способность первичных повреждений различных типов: модификацийоснований, двунитевых разрывов, пиримидиновых димеров, индуцированных эталоннымимутагенами, а также модификаций и неспаренностей оснований, возникших на фонедефектов систем репарации, проявляться фенотипически.2. Определить временные параметры процесса устранения и фенотипическогопроявления первичных повреждений относительно стадий клеточного цикла.Научная новизна.
В представленной работе впервые установлена молекулярнаяприрода первичных повреждений ДНК, способных проявляться фенотипически в альфатесте, а также исследована возможность их фенотипического проявления на разныхстадиях клеточного цикла. Впервые с использованием изогенных штаммов дрожжей былопроведено комплексное исследование эталонных мутагенов и дефектов систем репарациив альфа-тесте, состоящем из двух взаимодополняющих систем: тестов на "незаконную"гибридизацию и "незаконную" цитодукцию. Дополнительно в ходе исследования было9установлено, что дрожжевые клетки, потерявшие хромосому III, способны вступать вгибридизацию.Теоретическая и практическая значимость работы. Изучение процессапреобразования первичного повреждения в наследуемое изменение генетическогоматериала представляет особый интерес, как с теоретической, так и с практической точекзрения.
Исследования в этой области важны для понимания механизмов становлениямутаций, реципрокной и других типов рекомбинации и иных нарушений генетическогоматериала, а также для дальнейшего развития генетической токсикологии и исследованиямеханизмов, блокирующих мутагенез. Полученные результаты вносят вклад в развитиетеории мутационного процесса, а также будут полезны для дальнейшего изучениявзаимодействия систем репликации и репарации генетического материала, и исследованияточностирепарации, ипонимания фундаментальных механизмовизменчивости.Результаты работы могут быть использованы в дальнейших исследованиях в областиобщей биологии и генетики, мониторинга состояния окружающей среды, а также дляразработки и совершенствования систем тестирования генетической активности факторов,обладающих потенциальной мутагенной и канцерогенной активностью, что необходимодля защиты генома человека и животных от эндогенных и экзогенных мутагенныхфакторов.
Полученные нами результаты могут быть использованы в лекциях по курсам"Репликация, репарация и мутагенез", "Молекулярная генетика", "Частная генетикадрожжей", "Механизмы модификаций. К общей теории изменчивости", читаемых накафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургский государственного университета,а также в образовательном процессе в биологических и медицинских высших учебныхзаведениях России, таких как Санкт-Петербургский государственный университет,Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,Московский государственный университет, Новосибирский государственный университети др.Методология и методы исследования. В представленной работе использованинтегральный подход, сочетающий методы классической и молекулярной генетики,современныемолекулярно-генетическиеицитологическиеподходы.Вработеиспользован широкий спектр молекулярно-генетических методов (клонирование генов,трансформация клеток дрожжей и бактерий, полимеразная цепная реакция, методы подизайнупраймеровиплазмид,методиндукциипотерихромосом),методыфлуоресцентной микроскопии, проточная цитометрия, компьютерный анализ данных истатистические методы для оценки достоверности результатов.
Исследование проводили с10использованием в качестве модельного объекта эукариотических микроорганизмов грибовSaccharomyces cerevisiae.Положения, выносимые на защиту:Модификации оснований и двунитевые разрывы ДНК могут проявлятьсяфенотипически в альфа-тесте до их устранения системами репарации или превращения внаследуемые изменения генетического материала. Неспаренности оснований не имеютсамостоятельного фенотипического проявления в альфа-тесте и могут быть учтены толькопосле их превращения в наследуемые изменения генетического материала. В зависимостиот молекулярной природы первичного повреждения и связанной с этим его способностьюнарушатьматричныепроцессы,большинствопервичныхповреждениймогутфенотипически проявляться в альфа-тесте в пределах одного клеточного цикла.