Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах), страница 6

СЖК (наряду с глюкозой)подавляют экспрессию гена инсулина и уменьшают секрецию инсулина, но делают это ненапрямую, а опосредованно [72]. В результате этерификации СЖК образуются, в частности,церамиды, воскообразные липиды, состоящие из сфингозина (2-амино-4-октадецен-1,3диол) и жирной кислоты.Церамиды в больших концентрациях присутствуют в клеточных мембранах, составляя основу сфинголипидов (например, сфингомиелина), класса фосфолипидов клеточныхмембран. Церамиды являются не просто структурными элементами, но участвуют во внутриклеточной сигнализации, регулируя дифференцировку, пролиферацию, программируемую клеточную гибель клеток [73,41].

Метаболическое профилирование ЖК оказалосьочень перспективным методом, который может повысить чувствительность и специфичность диагностики, дискриминировать диабет 2-го типа от различных стадий ДН. В одномиз исследований в плазме крови больных было идентифицировано 15 СЖК и 15 ЭЖК, приэтом наиболее информативным показателем оказалась арахидоновая кислота и ее производные, которые участвуют в синтезе простагландинов - известных участников воспалительных процессов [71]. Эндотелий сосудов – одна из главных мишеней СЖК, а поражениемикрососудов почек – главная причина ДН [74,75].МиопатияНарушение нормальных процессов окисления ЖК является причиной важнойгруппы заболеваний, которые могут сопровождаться тяжелыми осложнениями, в том числе,со смертельным исходом.

Они охватывают широкий спектр клинических расстройств,включая миопатию, обусловленную накоплением липидов, прогрессивную кардиомиопатию, рецидивирующию гипогликемическую энцефалопатию или Рейе-подобный синдром,судороги, а также психические торможения. Среди прочих методов диагностики таких заболеваний применяется определение степени окисления дейтерированного пальмитата [1С], октаноата и бутирата, дейтерированной олеиновой кислоты в фибропластах, для уста-14новления специфики нарушений окисления ЖК [76].251.3. Инструментальные методы определения свободных и этерифицированных жирных кислот1.3.1 Определение жирных кислот методами газовой хроматографии.Наличие у ЖК полярных функциональных групп, которые препятствуют их качественному и количественному определению методом ГХ-МС, обуславливает необходимость проведения предварительной дериватизации перед анализом.

В литературе описаныосновные подходы к дериватизации ЖК, однако существуют методы определения ЖК и бездериватизации, но обычно они используются для определения высоких концентраций ЖК,или для достаточно простых матриц, наподобие фармакологических добавок с малым содержанием примесей [77].Один из самых популярных методов дериватизации карбоновых кислот, это переводих в метиловые эфиры. При метилировании происходит конверсия органических кислот вих метиловые эфиры, более удобные для ГХ анализа соединения за счёт уменьшения полярности и увеличения летучести [78].Основно-катализируемые реакции дериватизации ЖКОсновно-катализируемые реакции чаще всего используют для определения ЭЖК.Применяемые для этой процедуры реагенты редко подходят для этерификации СЖК. Самый распространенный агент для конверсии ацилглицеридов в метиловые эфиры это метоксид натрия в метаноле [79].

Этот реагент, однако, не может быть успешно применен вслучае высокой концентрации СЖК в анализируемой пробе [80]. Реакция переэтерификации протекает быстро даже при комнатной температуре. В таких мягких условиях не протекают реакции изомеризации двойных связей в ЖК, а также не происходит высвобождениеальдегидов из плазмалогенов, которые могут помешать хроматографическому определению.

В таких условиях не происходит переэтерификация сфигнолипидов и холестерола, длякоторых требуются более жесткие условия. Особенностью этого основно-катализируемогометода переэтерификации является отсутствие конверсии СЖК в метиловые эфиры. Условием протекания реакции является отсутствие воды в пробе, так как в противном случаепроисходит гидролиз сложных эфиров с образованием карбоновых кислот, что может вестик потерям при определении ЭЖК. Увеличение времени реакции дериватизации может статьпричиной изменения исходного состава ЖК, например, высокие концентрации основанияи высокая температура может привести к образованию сопряженных (конъюгированных)ЖК.Наряду с метоксидом натрия часто используют спиртовой раствор гидроксида калия.Чаще всего он используется для переэтерификации глицеридов при анализе масел.26Было отмечено, что процедура с метоксидом калия (реакция с которым протекаетоколо двух минут) подходит для определения ЖК, входящих в состав большого количестваразнообразных жиров.Намного реже для этерификации масел и жиров используются растворы гуанидинаи его алкилпроизводны в метаноле.

Этот щелочной реагент катализирует комплексный метанолиз масел, превращает ацилглицериды и свободные ЖК в их метиловые эфиры. Этотреагент также необходимо удалить из пробы перед газохроматографическим анализом. Реакция проходит в мягких условиях, поэтому не протекают реакции изомеризации двойныхсвязей, время пробоподготовки занимает 2 минуты на водяной бане.Кислотно-катализируемые реакции.Среди всех разновидностей кислотно-катализируемых реагентов только трифторидбора в метаноле конвертирует и ацилглицериды, и свободные ЖК в метиловые эфиры.

Применение трифторида бора для определения ЖК описано еще в 1964 г [81]. Он является реакционноспособным переэтерифицирующим реагентом, способен реагировать с плазмалогенами и высвобождать альдегиды, которые затем конвертируются в диметилацетали. Присутствие диметилацеталей в пробе может мешать газохроматографическому анализу ЖК.Система BF3-метанол, реагируя с холестеролом, образует холестириловый метиловый эфири холистадиен, которые также являются мешающими компонентами при определении ЖК.Кроме того, раствор трехфтористого бора в метаноле имеет ограничения по возможнымусловиям хранения [79]. В работе [82] систему BF3-метанол применяли для определенияжирно-кислотного состава триглицеридов. Для этого производили экстракцию липидовкрови смесью хлороформ/метанол, а затем к высушенному осадку добавляли трифторидбора с метанолом.

Возможность применения трифторида бора для анализа ЖК сывороткикрови и мембран эритроцитов описана в [83]; при это была использована экстракция липидов смесью хлороформ-метанол. Трифторид бора может быть использован как отдельно,для переэтерификации ЭЖК, таких как холестерин и триглицериды, так и в комбинации сметанолом и гидроксидом натрия для конверсии метиловых эфиров и СЖК, полярных эфиров, ТГ и т.д. [84].Хлорид алюминия в метаноле также используют для переэтерификации некоторыхлипидов. В молочных и овощных маслах этот реагент может быть использован без предварительной экстракции липидов.

Хлорид алюминия в метаноле сравним с системой BF3метанол по возможности переэтерификации холестероловых эфиров. Продукты метилирования, которые содержатся в пробе после реакции, не мешают последующему ГХ анализу.Однако такой способ не подходит для метилирования СЖК [85,79].27Ацетилхлорид также, как и хлорид алюминия, добавляют в пробу без предварительнойпробоподготовки,азатемпроизводятэкстракциюметиловыхэфировн-гексаном [85]. С помощью ацетилхлорида в исследовании [86] проводили метилированиехолестероловых эфиров, фосфолипидов и сфингомиелина смесью метанол-бензол-ацетилхлорид.

В результате авторы установили, что такая смесь применима для широкого спектралипидов, однако не подходит для дериватизации СЖК.Метанольный раствор соляной и серной кислот часто используют для метилирования как СЖК, так и для переэтерификации сфинголипидов [85]. Для определения СЖК используют 2, 5 или 10% растворы серной кислоты в метаноле и выдерживают при 60-70С втечении часа [54].Было проведено исследование [87] кислотно-катализируемой дериватизации с использованием ацетил хлорида 5% и 10%, 2% H2SO4, 5% H2SO4, 14% BF3 и 5% HCl в метаноле.

От процентного соотношения реагентов зависел выход метиловых эфиров различныхтипов липидов триглицеридов, фосфолипидов и холестерина. Наибольший общий выходреакции наблюдали при использовании 5% ацетилхлорида в метаноле, - Реакция проходила30 минут при 90 °С.Так как ЖК в организме человека находятся в двух видах - в этерифицированном инеэтерифицированном, то их раздельное определение может дать полную картину о нарушении метаболизма.

Например, был описан метод построения метаболического профиляпациентов с заболеванием диабета 2го типа. Для этого было предложено сначала метилировать этерифицированные ЖК с помощью 0,4М гидроксида натрия в метаноле и провестижидкость-жидкостную экстракцию для их извлечения из плазмы. Затем в остаточнойплазме провести метилирование неэтерифицованных ЖК с помощью 5% серной кислоты вметаноле при 70°С 30 минут. Выход продуктов составил около 80%. Таким образом былоопределено 20 ЖК в этерифицированном и неэтерифицированном виде [88,89].Одним из главных недостатков метилирования является относительно длительноевремя реакции и высокая температура, что способствует изменению структуры определяемых ЖК.Помимо метилирования, для дериватизации ЖК можно использовать различные реагенты, например, такие, как бис-триметилсилил-трифторацетамид (BSTFA [90], N-метилN-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамид (MTBSTFA [91].

бис-(Пентафторфенил)диметилсилан, реакция с которым проходит всего 15 минут при комнатной температуре, является одним из наиболее мягких и надежных способов дериватизации [92]. Описан методдериватизации пентафторбензилбромидом (PFBBr), в котором определяли 33 свободные28ЖК в плазме. Продолжительность реакции составляла 20 минут при комнатной температуре, а пределы обнаружения составили 0,05-1 пг/мкл.1.3.2 Определение жирных кислот методом жидкостной хроматографииВ связи с тем, что определение ЖК методом ГХ-МС сопряжено с необходимостьюпроведения трудоёмкой и времязатратной процедуры дериватизации, жидкостная хроматография является хорошей альтернативой.