Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах), страница 7

Благодаря мягким условиям подготовки проб,возможно определение низких эндогенных концентраций полиненасыщенных ЖК, эйкозаноидов (эйкозаноиды – это класс более 100 липидных медиаторов, производимых из С20полиненасыщенных кислот, таких как арахидоновая, эйкозапентаеновая) [93], различныхметаболитов [94] и продуктов окисления [95]. Мягкие условия подготовки проб позволяютснизить неконтролируемые изменения в структурах аналитов.В работе [93], для определения 6 полиненасыщеннвх кислот, 14 эйкозаноидов и 3окисленных метаболитов применяли осаждение белков и онлайн-ТФЭ в сочетании с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, разделение компонентов пробы проводили на неполярной хроматографической колонке С18, для уверенной идентификациисоединений были подобраны специфические МRМ-переходы.

Предложенный метод отличается быстрой пробоподготовкой с возможностью автоматизации. Пределы обнаружениясоставили 200-1000 нг/мл для полиненасыщенных ЖК и 10-1000 пг/мл для метаболитов.Для ЖХ описаны, в том числе, методы подготовки проб, включающие стадию дериватизации. Например, было предложено проводить определение ЖК в тканях атеросклеротических бляшек после их удаления с внутренней стенки артерии. Для этого, сначала проводили экстракцию ЖК из матрицы с помощью раствора хлороформа в метаноле, затемполученную смесь гидролизовали с помощью 40% гидроксида калия, далее проводили дериватизацию свободных ЖК диметиламиноэтанолом с добавлением метилиодида.

Полученные триметиламиноэтиловые эфиры ЖК определяли методом ВЭЖХ/МС-МС, пределыобнаружения составили 4-40 нг/мл [96].1.3.3. Определение жирных кислот методом капиллярного электрофорезаКак было отмечено выше, определение транс-ЖК кислот методом ГХ сопряжено срядом проблем, связанных с необходимостью введения стадии дериватизации среднелетучих и нелетучих аналитов [97]. Необычной альтернативой методам определения транс-ЖКявляется капиллярный электрофорез.КЭ - это инструментальная техника с высоким разрешением, которая позволяет разделять сложные комплексы биологических и химических смесей, что делает этот методпривлекательным для определения различных липидов [98].29КЭ для определения транс-ЖК начали применять с 2003 г., основным объектом исследования стали пищевые продукты [99].

В работе [97] КЭ использовали для определениятранс-ЖК в продуктах питания. Для этого липидную фракцию обрабатывали растворомNaOH/MeOH, а затем пробы были проанализированы на капиллярном электрофорезе Agilent Technologies с ультрафиолетовым детектором (длина волны 200 нм). Анализ ЖК проводили в буфере, рН которого выше рК кислот (выше 5), соответственно анализ проводилсяанионной формы ЖК. Таким образом были проведены анализы ненасыщенных ЖК C19:1,C18:1t, C18:1c, C18:2, C18:3. Сравнение результатов процедуры по определению транс-ЖКна КЭ и ГХ не показало значительной разницы, однако использование КЭ позволяет значительно сократить время анализа и пробоподготовки. Недостатком метода является низкаячувствительность по сравнению с ГХ, например, в шоколадной продукции методом КЭ обнаружить транс-жиры не удалось из-за низкого предела обнаружения.

В работе [100] КЭиспользовали для определения транс-ЖК в сырной продукции.Известны работы по применению КЭ для определения фосфолипидов в крови [101],показано, что метод КЭ составляет хорошую альтернативу тонкослойной хроматографии.В работе [102] показан пример сопряжения КЭ и масс-спектрометра с ионизациейэлектрораспылением. Пределы обнаружения составляли 20 мкг/мл для лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот.1.3.4.

Методы экстракции жирных кислот из биологических образцовЧаще всего, содержание эндогенных кислот определяют в плазме крови, реже в моче[88]. Иногда проводится более избирательный анализ, например, на содержание ЖК в мембранах эритроцитов [103] или в тканях атеросклеротических бляшек [78].Основным методом экстракции, применяемым как до, так и после дериватизации,является жидкость-жидкостная, с использованием, например, н-гексана [104,105], дихлорметана, этилацетата в качестве экстрагентов [106]. Наряду с жидкость-жидкостной применяют твёрдофазную экстракцию (ТФЭ) с использованием патронов С18 [93] и Strata-X(Phenomenex, Macclesfield, UK) [107]. Преимуществом ТФЭ является возможность автоматизации пробоподготовки, что приводит к ускорению процесса и минимизирует ошибки.Экстрактивное алкилированиеОсобое внимание к экстрактивному алкилированию с точки зрения применения ванализе связано с тем, что в этом процессе объединяются стадии экстракции и получениялетучих производных анализируемых веществ.

Реакции протекают в мягких условиях, причём использование межфазных агентов позволяет уменьшить продолжительность реакцийи увеличить выходы продуктов. В качестве катализатора межфазного переноса использу30ются четвертичные аммониевые и фосфониевые или другие ониевые соли, например, тетрабутиламмонийбромид,бензилтриэтиламмонийхлорид,трибутилгексадецилфосфо-нийбромид [108].Особенно важно при определении ЖК предотвратить реакции гидролиза липидов.Для оценки возможного вклада реакций гидролиза и переэтерификации, в работе [1] авторыпровелирядэкспериментовсвнесениемвсывороткукровирастворовL-α-дипальмитоиллецитина и триолеина в хлороформе.

После процедуры экстрактивного алкилирования метилиодидом с катализатором межфазного переноса гидроксидом тетрабутиламмония установили, что процессы гидролиза и переэтерификации липидов в условияхэкстрактивного алкилирования протекают в незначительной степени и не вносят заметноговклада в результаты определения СЖК.Твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ)В работе [109] показана возможность извлечения коротко- и среднецепочечных ЖК(С2-С10) из плазмы методом твёрдофазной микроэкстракции (ТФМЭ).

Для этого авторы использовали волокно покрытое дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксаном. Достигнутый предел обнаружения на стандартных образцах ЖК составил 200 мкг/мл, применениевысаливания с использованием комбинации солей (NH4)2SO4/NaH2PO4 позволила увеличить чувствительность метода. Такая комбинация оказалась намного эффективней, чем внесение смеси NaCl/Na2SO4. В качестве матрицы для исследования были взяты образцы сыраи вин, но метод пригоден и для сложных биологических матриц, таких как плазма крови.

Вработе [110] посвященной исследованию СЖК в сыре были достигнуты пределы обнаружения в 7 мкг/кг.В работе [111] описана разработка метода, который может быть применен дляоценки пребиотиков, представляющих различные источники неперевариваемых углеводовв ферментных моделях. В этой работе авторы применяли ТФМЭ для определения СЖК вкишечных ферментах. Для этого была создана модельная смесь ферментов и бактерий,находящихся в толстой кишке. Применяли различные волокна для ТФМЭ среди которыхдивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксан показал хорошую экстракцию для летучих короткоцепочечных ЖК (масляной, изовалериановой, валериановой к-ты). Карбоксен/полидиметилсилоксан показал лучшую экстракцию для муравьиной и пропионовойкислоты. Преимущество метода состоит в отсутствии процедуры дериватизации и уменьшении влияния сложной матрицы на ГХ определение.1.3.5.

Предварительное хранение и транспортировка биологических пробК условиям хранения можно отнести следующие параметры: продолжительностьхранения, температура и количество циклов замораживания и размораживания (далее31циклы з/р) [4]. В простейшем случае, до того как образец попадет в химико-аналитическуюлабораторию, он будет заморожен до -20 °С (реже до -70 °С) в течение 24 часов, и, соответственно, пройдет один цикл з/р. Большой объем отобранных образцов приводит к большейпродолжительности хранения, а создание лабораторного “банка” образцов и применениеразличных методов анализа увеличит количество циклов з/р. Исследования влияния такихциклов на концентрации эндогенных соединений в образце, стали особенно актуальными всвязи с формированием крупных “банков” биологических образцов [112], которых в настоящее время существует значительное количество [113,114].Подробно влияние условий хранения биообразцов на достоверность результатов метаболического профилирования методами ГХ-МС рассмотрено в различных работах[115,116].

Авторами [117] показано, что при соблюдении строгих требований к условиямхранения и транспортировки биологических образцов, вариации результатов анализа, обусловленные хранением, значительно ниже, чем индивидуальные вариации метаболическихпрофилей.Оценка влияния условий хранения на результаты определения ЖК в биологическихобразцах произведена в нескольких работах на примере различных биологических образцов. Например, отмечено [118] увеличение концентраций СЖК при хранении на 32%, атакже уменьшение концентраций триглицеридов, являющихся основным источникомЭЖК, на 19%. В работе [119] выявлено увеличение концентраций ЭЖК и некоторое уменьшение концентраций СЖК в процессе хранения (1 цикл з/р и хранение при комнатной температуре или при -40 °С в течение 6 месяцев).В других работах отмечается отсутствие наблюдаемых изменений [120]. Тем не менее, в этой работе отмечается, что выявленные изменения затрагивают только минорныеЖК, и не затрагивают основные компоненты жирнокислотного состава образцов.