Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ«НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГИГИЕНЫ,ПРОФПАТОЛОГИИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА»ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВАНа правах рукописиОРЛОВА Татьяна ИгоревнаСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДВУХСТАДИЙНОЙ МЕТОДИКИХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ИЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХСпециальность 02.00.02 – аналитическая химияДиссертациядиссертации на соискание учёной степеникандидата химических наукНаучный руководительк.х.н., Уколов А.И.Санкт-Петербург,2016ОГЛАВЛЕНИЕ1 Обзор литературы .......................................................................................................................

71.1. Структура, состав и свойства жирных кислот ..................................................................... 71.2 Биологическая роль жирных кислот и их значение в медицине и токсикологии ........... 131.2.1 Химические классы липидов плазмы крови .................................................................... 131.2.2 Биологическая роль жирных кислот ................................................................................. 181.2.3 Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии .........................

211.3. Инструментальные методы определения свободных иэтерифицированных жирных кислот ......................................................................................... 261.3.1 Определение жирных кислот методами газовой хроматографии. ................................ 261.3.2 Определение жирных кислот методом жидкостной хроматографии ............................ 291.3.3. Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза ......................... 291.3.4. Методы экстракции жирных кислот из биологических образцов ................................ 301.3.5.

Предварительное хранение и транспортировка биологических проб .......................... 311.4. Характеристика объектов исследования: химические соединения,потенциально влияющие на метаболизм липидов в организме. ............................................. 341.4.1 Фосфорорганические соединения ..................................................................................... 341.4.2 Мельдоний...........................................................................................................................

361.4.3 Фторацетат .......................................................................................................................... 372 Экспериментальная часть ........................................................................................................ 392.1 Методика определения свободных жирных кислот ........................................................... 392.2 Методика совместного определения свободных и этерифицированныхжирных кислот ............................................................................................................................. 432.3 Определение оптимальных условий хранения и транспортировкибиологических образцов .............................................................................................................

462.4 Исследование влияния фосфорорганических соединений на профилижирных кислот плазмы крови крыс ........................................................................................... 472.5 Исследование влияния мельдония на профили жирных кислот плазмы кровипрактически здоровых добровольцев ........................................................................................ 482.5 Исследование влияния фторацетата на профили жирных кислот плазмыкрови крыс ....................................................................................................................................

482.6 Исследование влияния алифатических углеводородов на профилижирных кислот плазмы крови и тканей печени и головного мозга крыс. ............................. 4922.7 Статистическая обработка полученных результатов ......................................................... 503 Результаты и их обсуждение ................................................................................................... 513.1 Хроматографическое разделение .........................................................................................

513.2 Подготовка проб к анализу ................................................................................................... 523.3 Построение градуировочных зависимостей ....................................................................... 583.4 Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме кровиметодом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием .....................623.5 Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определенияжирных кислот методом газовой хроматомасс-спектрометрии .............................................

683.6 Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введениисублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx,с применением антидотной терапии .......................................................................................... 733.7. Влияние мельдония на метаболизм жирных кислот ......................................................... 823.8 Исследование энергетического метаболизма крыс при действии фторацетата .............. 853.9.

Изменения профилей жирных кислот тканей печени и головного мозга крыс прихроническом ингаляционном воздействии малых доз алифатических углеводородов ....... 88Заключение................................................................................................................................... 98Выводы ....................................................................................................................................... 101Список литературы .................................................................................................................... 1023ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯАЛК – альфа линоленовая кислотаАЛТ – аланинтрансаминазаАСТ – аспартаттрансаминазаАХЭ – ацетилхолинэстеразаВЭЖХ-МС – жидкостная хроматография-масс-спектрометрияГХ-МС – газовая хроматография-масс-спектрометрияДН - диабетическая нефропатияДГ – диглицеридыЖК – жирные кислотыЖХ – жидкостная хроматографияКАТ – каталазаКЭ – капиллярный электрофорезЛК – линолевая кислотаЛПВП – липопротеины высокой плотностиЛПНП – липопротеины низкой плотностиЛПВП-Х – холестерол ЛПВПМДА – малоновый диальдегидМНЖК – мононенасыщенные жирные кислотыОХ – общий холестеролПНЖК – полиненасыщенные жирные кислотыСЖК – свободные (неэтерифицированные) жирные кислотыСОД – супероксиддисмутазаТБАГ – гидроксид тетрабутиламмонияТГ – триглицеридыТФМЭ – твердофазная микроэкстракцияУВ – углеводородыФА –фторацетатФИ – фосфатидилинозитолФК - фосфатидная кислотаФЛ – фосфолипидыФОС - фосфорорганические соединенияФС – ФосфатидилсеринФХ - фосфатидилхолин (лецитин)ФЦ – фторцитратФЭА - фосфатидилэтаноламин (кефалин)ЭЖК – этерифицированные жирные кислоты4ВВЕДЕНИЕХроматомасс-спектрометрические методы исследования профилей низкомолекулярных соединений - метаболитов крови и других биологических образцов приобретаютвсе большее значение в современной токсикологии и фармакологии.

Исследование метаболических профилей вносит значительный вклад в развитие лабораторно-клинической диагностики, например, исследования маркеров обмена жирных кислот (ЖК) являются однимиз ключевых направлений в ранней диагностике сердечно-сосудистых рисков и метаболического синдрома.Для достоверной диагностики кризисных состояний организма необходимо определение ЖК в биологических образцах в свободной (СЖК) и этерифицированной (ЭЖК) формах. Изменения концентраций СЖК и ЭЖК являются следствием метаболической саморегуляции, а также маркерами поражения или дисфункции органов.Разработка надежной процедуры определения большого числа ЖК в свободной иэтерифицированной формах позволит усовершенствовать методы диагностики метаболического синдрома, наследственных и онкологических заболеваний, а также осуществитьраннее (доклиническое) выявление отклонений у лиц, находящихся в зоне риска.Основной метод определения ЖК в сыворотке или плазме крови - это жидкость-жидкостная экстракция и газовая хроматография (ГХ) с пламенно-ионизационным детектированием.

Сочетание метода ГХ с масс-спектрометрией имеет ряд неоспоримых преимуществкак в части надежности идентификации аналитов, так и чувствительности, и селективностиих определения. К недостаткам метода ГХ при любом варианте детектирования стоит отнести необходимость предварительной дериватизации аналитов, т.к. жесткие условия дериватизации могут спровоцировать неблагоприятные побочные реакции: изомеризацию непредельных ЖК и их окисление, причем скорость окисления возрастает с повышением степенинепредельности.

Таким образом, для повышения правильности и точности определения ЖКметодом ГХ-МС, необходима разработка мягких методов дериватизации.В качестве способа извлечения и дериватизации СЖК нами выбрано экстрактивноеалкилирование иодистым метилом. Прототипом послужила процедура, описанная в работе[1]. Возможности метода были нами впоследствии расширены за счет оптимизации анализадругих видов биологических образцов, помимо плазмы крови: мочи и гомогенатов органов;список определяемых соединений расширен с 5 до 32 (включая важнейшие маркеры сердечно-сосудистых заболеваний - полиненасыщенные ЖК) [2], однако главным преимуществом стала возможность определения ЖК в этерифицированной форме [3].