Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах), страница 10

Полученный раствор выпаривали под током азота доконечного объема около 50 мкл. Затем пробу разбавляли 50 мкл гексана и перемешивали ввортексе в течение 10 мин, после чего раствор переносили в виалу емк. 100 мкл и анализировали 1 мкл методом ГХ-МС.Подготовка проб мочи к анализуОбразец мочи объемом 0,5 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования емк.

15 мл и прибавляли 1 мл метанола и 2 мл фосфатного буферного раствора с pH 8,после тщательного перемещивания в полученный раствор вносили 10 мкл внутреннегостандарта (раствор пальмитиновой кислоты d31 с концентрацией 5 мг/мл), 140 мкл 0,2 Мраствора гидроксида тетрабутиламония, 200 мкл иодистого метила и 2 мл дихлорметана [2].Полученную смесь тщательно перемешивали 15 мин. Затем смесь центрифугировали 3 минпри 4000 g, отделяли и отбрасывали водный верхний слой, а в нижний органический слойдобавляли осушитель − безводный сульфат натрия. Тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость в пробирки емк. 2 мл. Полученный растворвыпаривали под током азота до конечного объема около 50 мкл. Затем пробу разбавляли 50мкл гексана и перемешивали в вортексе в течение 10 мин, после чего раствор переносили ввиалу емк.

100 мкл и анализировали 1 мкл методом ГХ-МС.Масс-спектрометрическое детектированиеВ качестве режима ионизации использовали ионизацию электронами при 70 эВ. Детектирование осуществляли в режиме мониторинга избранных ионов. Такой режим значительно повышает как чувствительность за счет увеличения специфичности, так и селективность путем уменьшения фоновых сигналов от матрицы. Идентификация целевых компо40нентов осуществлялась из предустановленной библиотеки NIST. Для подтверждения каждого компонента требуется два или три характеристичных иона.

Для насыщенных ЖК характерной и самой интенсивной была масса 74, для ненасыщенных - 55,79,67. Эти значениябыли использованы в дальнейшем для количественной обработки. В качестве второго характеристичного иона выбирали молекулярный ион метилового эфира ЖК, если он был обнаружен.

Для компонентов, для которых не удалось добиться полного хроматографического разделения, при одинаковых характеристичных ионах с целью идентификации и количественной обработки выбирали молекулярные ионы метиловых эфиров ЖК. Условиярегистрации избранных ионов представлены в таблице 7.Таблица 7 - Условия регистрации избранных ионов№ п/п1234567891011121314151617181920212223Определяемый компонентВремяуд-ия,минМетиловый эфир гексановой кислоты5,878Метиловый эфир гептановой кислоты6,930Метиловый эфир октановой кислоты7,863Метиловый эфир нонановой кислоты8,820Метиловый эфир декановой кислоты9,915Метиловый эфир ундекановой кислоты 11,207Метиловый эфир додекановой кислоты 12,724Метиловыйэфиртридекановой 14,399кислотыМетиловыйэфирмиристиновой 16,205кислотыМетиловый эфир пентадекановой 18,046кислотыМетиловый эфир пальмитолеиновой 19,565кислотыМетиловыйэфирпальмитиновой 19,927кислотыМетиловыйэфиргептадекановой 21,734кислотыМетиловый эфир линолевой кислоты22,972Метиловый эфир олеиновой кислоты23,093Метиловый эфир линоленовой кислоты 23,105Метиловый эфир элаидиновой кислоты 23,196Метиловый эфир цис-6-октадеценовой 23,196кислотыМетиловый эфир стеариновой кислоты 23,534Метиловыйэфирнонадекановой 25,280кислотыМетиловыйэфирарахидоновой 25,815кислотыМетиловый эфир арахиновой кислоты 26,937Метиловыйэфиргенэйкозановой 28,544кислоты41m/z1m/z2dwelltime747474747474747499871278714314321422810101010101010107424210742561055236107427010742841029429629229629610101010107474298871010791501074743263401010№ п/п24252627282930313233343536373839Определяемый компонентВремяуд-ия,минМетиловый эфир эруковой кислоты29,722Метиловый эфир бегеновой кислоты30,110Метиловыйэфиртрикозановой 31,606кислотыМетиловый эфир нервоновой кислоты 32,724Метиловыйэфиртетракозановой 33,063кислотыМетиловый эфир цис-5,8,11,14,17-эйко- 25,940запентаеновой кислотыМетиловый эфир цис-8,11,14-эйкоза- 26,125триеновой кислотыМетиловый эфир цис-11,14-эйкозадие- 26,436новой кислотыМетиловый эфир гондоиновой (цис-11- 26,525эйкозеновой) кислоты)Метиловый эфир миристолеиновой 15,990кислотыМетиловый эфир цис-10-пентадекано- 17,831вой кислотыМетиловый эфир цис-10-гептадекано- 21,372вой кислотыМетиловый эфир гамма-линоленовой 22,696кислотыМетиловый эфир линолаэдиновой 23,103кислотыМетиловыйэфир 26,570цис-11,14,17-эйкозатриеновой кислотыМетиловыйэфир 29,670цис-13,16-докозадиеновой кислотыm/z1m/z2dwelltime320747435436810101055743483821010792011079320106732210793201055208105522210552821079292102941032079106735010При большом количестве перекрывающихся пиков в одной масс-хроматограмме,время сканирования по каждому значению m/z было подобрано так, чтобы чувствительность и точность не были потеряны из-за слишком короткого времени сканирования, искажения формы пика или недостаточного числа точек сбора данных на хроматографическийпик, для устранения этих проблем время регистрации разделяли на несколько окон (сегментов), в каждом из которых масс-спектрометр регистрировал только определенные значенияm/z [2].

Если анализируемые вещества элюировались на стыке двух сегментов, осуществляли настройку сегмента так, чтобы можно было зарегистрировать компонент, даже еслион сдвинется из одного сегмента в другой.Построение градуировочных зависимостейГрадуировочные зависимости строили по стандартным растворам ЖК после экстрактивного алкилирования из метанола. Были проанализированы градуировочные растворы сконцентрацией каждой кислоты 0,02; 0,2; 2; 4; 8; 20; 50 мкг/мл [2].42Определение воспроизводимости методикиВоспроизводимость количественного определения СЖК оценивали следующим образом: в объединенный образец плазмы крови от нескольких добровольцев вносили добавкустандартной смеси ЖК. Затем образец разделяли на 15 аликвот, в которых определяли СЖК[2].Апробацию методики проводили с использованием образцов плазмы крови и мочидобровольцев, а также лабораторных животных (самцы крыс).Группа добровольцев насчитывала 20 практически здоровых мужчин 20‒25 лет.

Отбор крови проводили с утра натощак из кубитальной вены в пробирки для гематологииVacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Отбор мочи проводили в тот же день утромнатощак. В моче предварительно измеряли содержание креатинина. В табл. 4 приведенырезультаты определения концентраций СЖК в плазме крови и моче добровольцев, а такжеплазме крови крыс [2].Самцы крысы (20 особей) получены из питомника Рапполово. Условия содержанияэкспериментальных животных соответствовали «Санитарным правилам по устройству,оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденных МЗ СССР 06.07.1973 г. и Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977г.

Кровь последекапитации отбирали в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта2.2 Методика совместного определения свободных и этерифицированных жирныхкислотДля определения метиловых эфиров ЖК использовали газовый хроматограф Agilent7890A, с масс-селективным детектором Agilent 5975С [3]. Газовый хроматограф оборудован капиллярной колонкой HP-5MS 30м х 0,25мм, 0,25 мкм. Условия газохроматографического разделения и масс-селективного детектирования приведены в таблице 8.43Таблица 8 - Условия газохроматографического разделения и масс-селективного детектирования метиловых эфиров ЖК [3]Условия анализаХарактеристикиГаз-носительГелий газообразный высокой чистоты марки 6.0, объемнаядоля гелия не менее 99.9999% об.Режим ввода пробыОбъем пробы 1 мкл, без деления потока (1 мин), под давлением69 кПаТемпературныйрежим 3 минуты при температуре 50 °С, затем подъем до 140 °С сотермостата колонкискоростью 20 °С/мин, затем подъем до 280 °С со скоростью5°С/мин, затем 8 минут при конечной температуре.Температура инжектора250 °СОбъемная скорость газа-но1 мл/минсителя через колонкуРежимработымасс- Ионизация электронами с энергией 70 эВ.

Температура источспектрометраника ионов: 280 °С. Температура квадруполя: 150 °С. Температура интерфейса: 280 °С. Масс-селективное детектирование врежиме мониторинга избранных ионов.Реактивы и стандартыСмесь метиловых эфиров ЖК (F.A.M.E. Mix C4-C24, Supelco, кат № 18919), наборстандартов насыщенных ЖК с нечетным числом атомов углерода (Supelco, кат № OC91KT), с четным числом атомов углерода (Supelco, кат № EC10A-1KT) и ненасыщенных ЖК(Supelco, кат № UN10-1KT) [3]. Внутренний стандарт – дейтерированная пальмитиноваякислота d31 (Supelco, кат № 366897).и дейтерированный эфир пальмитиновой кислоты(Supelco, кат № 366897). CH2Cl2, JTBaker, CH3I, Sigma-Aldrich, водный раствор гидроксидатетрабутиламмония (ТБАГ), Sigma-Aldrich. Гидроксид натрия, Sigma-Aldrich. Гексан, FlukaAnalytical.Подготовка образцов для анализаПоследовательность определения СЖК и ЭЖК в образце приведена на рисунке 10.Образец плазмы крови объемом 0,1 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования вместимостью 15 мл, прибавляли по 10 мкл внутренних стандартов (раствор пальмитиновой кислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл и раствор метилового эфира пальмитиновой кислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл) [3].

К полученному раствору прибавляли 1мл 0,4 М раствора NaOH в метаноле, тщательно перемешивали в вортексе в течение 10 мин,затем добавляли 2 мл гексана, полученную смесь опять перемешивали 10 мин. После центрифугирования пробы верхний слой, содержащий ЭЖК, переносили в пробирки Эппендорф, выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мкл CH2Cl2 и анализировали методом ГХ-МС. В оставшийся нижний слой, содержащий СЖК, добавляли 3 мл фосфатногобуфера с рН 8, выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут, затем добавляли200 мкл ТБАГ, 100 мкл CH3I и 3 мл CH2Cl2. Полученную смесь тщательно перемешивали втечение 10 минут, затем центрифугировали и отделяли верхний водный слой. Оставшийся44органический слой выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мкл CH2Cl2 и определяли СЖК методом ГХ-МС.Идентификационные и метрологические характеристики методики для метиловыхэфиров ЖК приведены в таблице 9.Таблица 9 - Масс-спектрометрические характеристики и времена удерживания метиловыхэфиров ЖК [3]ОтносительнаяМетиловый эфирВремя удошибка, %m/zжирной кислотыия, минЭЖКСЖКУндециловая, C11:011,1774, 1431417Лауриновая, C12:012,6874, 2141613Тридекановая, C13:014,3574, 228158Миристиновая, C14:016,1474, 24243Миристолеиновая, C14:116,9655, 20847цис-10-Пентадеценовая, C15:117,7755, 22216Пентадекановая, C15:017,9974, 25627Пальмитолеиновая, C16:1n-719,4755, 236311Пальмитиновая, C16:019,8874, 270311цис-10-Гептадеценовая, C17:121,3255, 25012Маргариновая, C17:021,6874,284216γ-Линоленовая, C18:3n622,6379, 29258Линолевая, C18:2n6c22,92294516Олеиновая, C18:1n9c23,03296612Линоленовая, C18:3n323,03292105Линоэлаидиновая, C18:2t23,05294Элаидиновая, C18:1n9t23,13296812Стеариновая, C18:023,4774, 298311Арахидоновая, C20:4n625,7579, 150611цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая, C20:5 25,8779, 201814цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n826,0579,320513цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:226,363221110цис-11-Эйкозеновая, C20:126,4629298цис-11,14,17-Эйкозатриеновая, C20:3n1126,5032017*12Арахиновая, C20:026,8874, 326912Генэйкозановая, C21:028,4974, 340154цис-13,16-Докозеновая, C22:229,61350Эруковая, C22:1n929,6732025*15цис-4,7,10,13,16,19-Докозагексаеновая,C22:6n329,9079, 91135Бегеновая, C22:030,0674, 3541212Трикозановая, C23:031,5574, 36824*7Нервоновая, C24:1n932,6655, 3484Лигноцериновая, C24:033,0174, 38218*6Внутренний стандарт: пальмитиновая кислота-d3119,47301Примечание: * - высокая погрешность обусловлена низкими концентрациями в исследуемых пробах, науровне или ниже предела определения.45Определение состава СЖК и ЭЖК в плазме крови человека проводили по разработаной методике.