Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах), страница 9

Разрушение гомеостаза липидов приводит к нейродегенерации [152], раку, ожирениюи атеросклерозу. В таблице 5 приведены некоторые примеры известных фактов указывающих на влияние ФОС на метаболизм липидов.Известные данные по влиянию ФОС на метаболизм липидов неоднозначны и трудноподдаются суммированию: во-первых, все ФОС, за исключением зомана и RVX, повышаютуровни ТГ в плазме крови; во-вторых, ФОС могут как повышать, так и снижать уровниЛПВП, причем изменения ЛПНП при этом обратно пропорциональны, в третьих, выявленоснижение уровней ФЛ, причем концентрации лизофосфатидилхолинов при этом повышаются.1.4.2 МельдонийВ настоящее время мельдоний (3-(2,2,2-триметилгидразин) пропионат) используетсяпри лечении ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, абстинентном алкогольном синдроме, острых нарушениях мозгового кровообращения и др.[153,154,155,156].

Структурная формула мельдония представлена на рисунке 8.Рисунок 8- Структурная формула мельдонияМельдоний является структурным аналогом гамма-бутиробетаина, он ингибируетгамма-бутиробетаингидроксилазу (EC 1.14.11.1), которая участвует в биосинтезе LкарнитинаN-метиллизинизгамма-бутиробетаина=>N,N-диметиллизин[157]=>посхеме:лизинN,N,N-триметиллизин=>=>N,N,N-гидрокситриметиллизин => триметиламмониобутаналь => гамма-бутиробетаин => Lкарнитин.

В результате блокируется транспорт длинноцепочечных ЖК в митохондрии; в тоже время, короткоцепочечные кислоты могут свободно проникать в митохондрии и окисляться там, при этом не происходит накопления недоокисленных ЖК внутри митохондрий[158,159]. Снижение уровня карнитина обусловливает активацию окисления длинноцепочечных ЖК в пероксисомах, защищая митохондрии при ишемии-реперфузии.К фармакологическим и биологическим эффектам мельдония относят: кардиопротекторное действие, улучшение расслабления кардимиоцитов в диастоле за счет активациитранспорта Ca2+ в эндоплазматический ретикулум, улучшение функционального состоянияэндотелия, расслабление гладкомышечных клеток сосудов, улучшение микроциркуляции,36стимуляция карнитин-независимого окисления ЖК, увеличение уровня интерферона, активация гуморального иммунитета, антикетогенный эффект, сохранение баланса прооксидантной и антиоксидантной систем при воздействии повреждающих факторов, уменьшениевнутрилегочного шунтирования, стабилизация мембран клеток, предотвращение метаболического ацидоза, активация гликолиза и ферментов цикла Кребса, мягкое разобщение дыхания митохондрий и усиление дыхательного контроля [160,161,162,163].

Мельдоний усиливает действие ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), нитроглицерина, антагонистов кальция, бета-адреноблокаторов и других антигипертензивных средств,потенцирует действие сердечных гликозидов [164].1.4.3 ФторацетатФторацетаты (ФА) - это высокотоксичные вещества, действие которых проявляетсяне сразу, но спустя латентный период, составляющий для человека от получаса до нескольких часов, даже при отравлении летальными дозами [165,166].

Механизм токсического действия ФА широко известен под названием “летальный синтез”, суть которого заключаетсяв превращении в клетках организма нетоксичного самого по себе ФА в токсичный фторцитрат (ФЦ) [167]. Метаболизм ряда соединений протекает с образованием в качестве промежуточного продукта ФА. Это противоопухолевые препараты (5-фторурацил и изомерыфторэтилнитрозомочевины), N-(2-фторэтил)-производные наркотических анальгетиковнормеперидина и норметазоцина, пестициды (1,3-дифтор–2-пропанол и фторацетамид), 1(ди)гало-2-фторэтаны и фторэтанол [168,169,170,171].

ФА оказался довольно сильным радиопротектором в силу своей способности снижать потребление кислорода и температурутела [172]. Кроме того, ФА может предупреждать развитие толерантности организма к морфину [173], недавно получены данные о противоопухолевом эффекте ФА [174].Особенности патогенеза при введении ФА окончательно не изучены. При отсутствии клинической и морфологической специфики для диагностических целей могут бытьиспользованы биохимические показатели, характеризующие принцип действия ФА,прежде всего это уровень цитрата и фтора [175]. Кроме того, физиолого-биохимическиеэффекты, вызываемые ФА, включают в себя отклонения в регуляции углеводного обмена иснижение концентрации СЖК [176, 177], однако данные, полученные разными исследователями, неполны и противоречивы1.4.5 Алифатические углеводороды с длиной цепи от 6 до 10 атомов углеродаСреди алифатических углеводородов наиболее токсичным и потому хорошо изученным является н-гексан, который применяется в качестве растворителя в нефтехимической,химической, металлургической, резиновой, текстильной, кожевенной и мебельной промышленности.

н-Гексан характеризуется высокой летучестью, высокой растворимостью в37жирах и способностью к аккумуляции в организме человека [178]. Длительный контакт рабочих с н-гексаном часто приводит к возникновению профессиональной патологии. Хроническое воздействие гексана может стать причиной нейропатий, заболеваний преимущественно периферических сенсорных и моторных нервов [179]. Основные проявления нейропатий – расстройство цветного зрения, нарушение регуляции деятельности сердца, слабостьи онемение конечностей, нарушения тактильной чувствительности [180].Таблица 6 - Известные результаты влияния н-гексана на организмЦелевойОписаниеорганУвеличение массы органа, ослабление способности к метаболизму ксенобиотиков.АСТ↑, АЛТ↑, щелочная фосфатаза↑, альбумин (в крови)↑, соПеченьдержание белка в печени↓, общий и прямой билирубин↑,СОД↑, КAT↑, глутатионпероксидаза↑, глутатион-S-трансфераза↑, GSH↓, H2O2↑, МДА↑, RSH↓, глюкозо-6-фосфатаза↓Гликоген печени ≈Увеличение массы органа.Морфология: от прогрессирующей дегенерации проксимальных канальцев с умеренным кровоизлиянием в интерстицийПочкивплоть до некроза почечных канальцев.Мочевина↑, креатинин↑, общий уровень электролитов вплазме↑, глутатионпероксидаза↑, глутатион-S-трансфераза↑,GSH↓.

H2O2↑, МДА↑Снижение активности AХЭ и нейронспецифической енолазы(ЕС 4.2.1.11). Повышенное фосфорилирование глиальногофибриллярного кислого белка в гиппокампе крыс.НервнаяЭнцефалопатия, возможно в результате нарушения интрацесистемаребральной проводимости.Набухание дистальных фрагментов аксонов при повышенном уровне нейрофиламентов диаметром 10 нм, валлеровская дегенерация удлиненных аксонов.Тестикулы Атрофия. Уменьшение массы в 3 раза.Поражение респираторного тракта. Изменения в составе легочного сурфактанта у крыс, значительное увеличение конЛегкиецентрации фосфолипидов в бронхо-альвеолярном лаваже.Жировая дистрофия пневмоцитов, изменения пластинчатыхтел пневмоцитов типа II.Липидный ЛПНП↑, ТГ↑, ОХ↑, ЛПВП↓профильСсылка[181,182,183][181][184,185,186, 187, 188,189, 190][191][192,193][181]Примечание: ↑ - увеличение концентрации; ↓ - уменьшение концентрации; ≈ - концентрация не изменилась;АЛТ – аланинтрансаминаза; АСТ – аспартаттрансаминаза; АХЭ – ацетилхолинэстераза; СОД – супероксиддисмутаза; КАТ – каталаза; МДА – малоновый диальдегид; GSH – глутатион восстановленный; RSH– сульфгидрильные группы; ЛПНП – липопротеины низкой плотности; ТГ – триглицериды; ОХ - общийхолестерол; ЛПВП - липопротеины высокой плотности.Известные факты влияния УВ (в основном гексана) на организм суммированы в таблице 6.

Несмотря на имеющиеся сведения о влиянии УВ на морфофункциональные и клинико-биохимические показатели, механизмы возникновения патологий нуждаются в уточнении.38Хотя возникновение нейропатии обычно связывают с накоплением нейрофиламентов [194], точный механизм этого процесса неизвестен. Выдвигается несколько гипотез[195] для объяснения воздействия алифатических углеводородов.Отсутствие сведений о ведущем механизме патогенеза при воздействии УВ определяет актуальность исследования воздействия нейротоксичных углеводородов на липидныепрофили внутренних органов и тканей, что, возможно, позволит выявить новые аспектыпатогенеза нейропатии.Определение воздействия токсичных соединений на липидные профили внутреннихорганов требует распространения метода определения СЖК и ЭЖК не только на плазмукрови, но и на гомогенаты тканей.

В результате выполнения этой задачи должна быть создана аналитическая методика, позволяющая проводить профилирование жирнокислотногосостава различных биологических объектов (как образцов биологических жидкостей, так ивнутренних органов). Результаты работы позволят получить новые сведения о влиянии токсичных химических соединений на метаболизм липидов и выйти на новый уровень оценкирисков, связанных с воздействием различных токсичных химических соединений. Разработанный метод позволит усовершенствовать методологическую основу доклинических иклинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, а также гигиеническогорегламентирования вредных химических веществ.

Метод может быть использован в центрах профпатологии, медико-биологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях.2 Экспериментальная часть2.1 Методика определения свободных жирных кислотДля определения ЖК применяли газовый хроматограф Agilent 7890A, оснащенныйавтодозатором Agilent G4513A, с масс-селективным детектором Agilent 5975С GC/MS, капиллярная колонка HP-5MS 30 м  0,25 мм  0,25 мкм [2]. Определение компонентов осуществляли при следующем температурном градиенте: выдержка 3 мин при 50°С, затемподъем до 140°С со скоростью 20 °С/мин, затем до 280 °С со скоростью 5 °С/мин и выдержка при конечной температуре 8 минут. Ионизация электронным ударом 70Эв. Детектирование в режиме мониторинга избранных ионов (SIM – режим).Реактивы и стандартыCмеси метиловых эфиров ЖК (Mix C4-C24), стандарты индивидульных ЖК, в томчисле, внутренний стандарт – дейтерированная пальмитиновая кислота d31 фирмыSUPELCO.

Дихлорметан, JT Baker. Метилиодид Sigma Aldrich. Натрия фосфат 2-замещён39ный 2-водный, ACROS. Натрия фосфат 1-замещённый, , Sigma Aldrich. Гидроксид тетрабутиламмония Sigma Aldrich гидроксид тетрабутиламмония использовали в виде 0,2 М водного раствора.Подготовка проб плазмы к анализуОбразец плазмы крови объемом 0,5 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования емк. 15 мл и прибавляли 10 мкл внутреннего стандарта (раствор пальмитиновой кислоты d31 с концентрацией 5 мг/мл) [2].

К полученному раствору прибавляли 2 млфосфатного буферного раствора с pH 8, 140 мкл 0,2 М раствора гидроксида тетрабутиламония, 200 мкл иодистого метила и 2 мл дихлорметана. Полученную смесь тщательно перемешивали 15 мин. Затем смесь центрифугировали 3 мин при 4000 g, отделяли и отбрасывали водный верхний слой, а в нижний органический слой добавляли осушитель − безводный сульфат натрия. Тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость в пробирки емк. 2 мл.