Диссертация (Совершенствование двухстадийной методики хромато-масс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в биологических образцах), страница 2

Селективноеодновременное определение СЖК и ЭЖК позволяет значительно сократить объем плазмыкрови, требуемый для проведения анализа.5Практика применения разработанной методики при выполнении медико-биологических исследований в НИИ ГПЭЧ показала, что результаты анализа зависят от условий хранения образцов плазмы крови [4]. К условиям хранения можно отнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура и количество циклов замораживания иразмораживания (циклов з/р).

Большой объем отобранных образцов приводит к большейпродолжительности хранения, а создание лабораторного “банка” образцов и применениеразличных методов анализа неизбежно приводят к увеличению количества циклов з/р. Исследования влияния количества таких циклов на концентрации эндогенных соединений вобразце стали особенно актуальными в связи с формированием крупных “банков” биологических образцов. Соблюдение надлежащих условий хранения и транспортировки биологических образцов позволяет значительно снизить вариации в результатах анализа. Количественная характеристика влияния условий хранения биологических образцов позволит значительно повысить надежность и достоверность определения ЖК.Настоящая работа посвящена совершенствованию методики количественного хроматомасс-спектрометрического определения ЖК в биологических образцах с целью установления механизмов воздействия токсичных химических соединений на организм, чтопозволит внести значительный вклад в практику лабораторно-клинической диагностики, атакже гигиенического регламентирования вредных химических веществ.Для разработки метода совместного хроматомасс-спектрометрического определенияЖК в плазме крови необходимо было решить следующие задачи: разработать подходы ксовместному определению свободных и этерифицированных ЖК плазмы крови людей илабораторных животных и произвести оценку метрологических характеристик методики.Оптимизировать методику для количественного определения ЖК в образцах гомогенатоворганов и тканей.

Обосновать условия хранения биологических образцов с момента отборадо подготовки проб к анализу. Апробировать разработанный подход при оценке влияниясублетальных доз фторацетата, зарина, зомана и российского вещества Vx, а также средствантидотной терапии на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы кровиэкспериментальных животных. Провести апробацию методики при оценке влияния лекарственных препаратов на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы кровиздоровых добровольцев-испытуемых (на примере мельдония).В результате выполнения работы создана аналитическая методика, позволяющаяпроводить профилирование жирнокислотного состава различных биологических объектов.Результаты работы позволили получить новые сведения о влиянии токсичных химическихсоединений на метаболизм липидов и повысить уровень оценки рисков, связанных с воздействием различных токсичных химических соединений.

Разработанный метод позволил6усовершенствовать методологическую основу доклинических и клинических исследованийв ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, а также гигиенического регламентирования вредныххимических веществ. Метод может быть использован в центрах профпатологии, медикобиологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях.1 Обзор литературы1.1.

Структура, состав и свойства жирных кислотЖирные кислоты представляют собой алифатические одноосновные карбоновыекислоты с открытой цепью, содержащиеся в основном в этерифицированной форме в жирах, маслах и восках растительного и животного происхождения [5]. Основные ЖК в организме человека имеют чётное число атомов углерода, что связано с особенностями их биосинтеза, при котором к углеводородному радикалу ЖК последовательно добавляютсядвухуглеродные фрагменты [6] (см. рисунок 2).Жирные кислоты являются структурными компонентами различных липидов.

В составе триацилглицеридов они выполняют функцию депонирования энергии, так как их радикалы содержат богатые энергией СН2-группы [7]. Благодаря своей структуре, при окислении связей С-Н ЖК дают в два раза больше энергии, по сравнению с полисахаридами,что делает жир наиболее эффективной формой для хранения избыточной энергии у живыхорганизмов.

Поскольку увеличение клеточной концентрации СЖК является токсичным,они хранятся в основном в виде триглицеридов во внутриклеточных нейтральных липидных каплях, которые функционируют и как резервуары энергии, и как запас ЖК и стеринов,необходимый для синтеза мембран [8]. Жиры и фосфолипиды организма при нормальнойтемпературе тела имеют жидкую консистенцию, так как количество ненасыщенных ЖКпреобладает над насыщенными. В фосфолипидах мембран ненасыщенных кислот можетбыть до 80-85%, а в составе жиров подкожного жира - до 60% [5].Свободные ЖК в организме природного происхождения, образованы посредствомферментативного гидролиза триацилглицеридов (ТГ).

В свободном, неэтерифицированномсостоянии ЖК в организме содержатся в небольшом количестве, например, в крови, где онитранспортируются в комплексе с белком альбумином [9].Жирные кислоты, как правило, содержат неразветвленную цепь из атомов углерода(С4-С24, включая углерод карбоксильной группы) и могут быть как насыщенными, так иненасыщенными [10]. По степени ненасыщенности ЖК подразделяют на насыщенные, вкоторых двойные связи С=С отсутствуют, мононенасыщенные содержащие одну кратнуюсвязь, и полиненасыщенные, в структуре которых содержится более одной кратной связи[11].

По длине углеродной цепи ЖК подразделяют на короткоцепочечные (от С4 до С6),7среднецепочечные (от С7 до С12) и длинноцепочечные (более С13). Короткоцепочечные ЖКзачастую представляют собой промежуточные продукты синтеза или деградации болеедлинных ЖК, в отличие от которых не являются основными компонентами биологическихмембран. В состав большинства мембран в организме входят липиды с ацильными группами, содержащими 14, 16, 18, 20, 22 или 24 атомов углерода [12].Многие ЖК еще до полного установления их строения имели тривиальные названия,и эти названия настолько прочно утвердились в литературе, что их трудно исключить изупотребления [13], поэтому правилами ИЮПАК для номенклатуры ЖК допускается использование их тривиальных названий [14].В соответствии с систематической номенклатурой, количество и положение двойных связей в ненасыщенных ЖК часто обозначают с помощью цифровых символов: например, олеиновую кислоту как 18:1;9, линолевую кислоту как 18:2;9,12, где первая цифра –число углеродных атомов, вторая – число двойных связей, а следующие цифры – номераближайших к карбоксилу углеродных атомов, вовлеченных в образование двойной связи[15].

Также позицию двойной связи обозначают знаком Δ, после которого указывают номератома углерода, ближайшего к карбоксилу, у которого находится двойная связь. Например,С18:1Δ9 означает, что ЖК содержит 18 атомов углерода и одну двойную связь у 9-го атомауглерода, считая от углеродного атома карбоксильной группы [6]. В настоящее время такжеприменяется собственная номенклатура ненасыщенных ЖК (т.н.

«омега-номенклатура»),предложенная Холманом в 1964 году [16]. Эта классификация позволяет учитывать путьобразования ЖК в организме. В ней концевой атом углерода, независимо от длины цепи,обозначается символом ω. Отсчет положения двойных связей производится не как обычноот карбоксильной группы, а от терминальной метильной группы [14]. Структура любой ненасыщенной кислоты может быть выражена тремя цифрами: числом углеродных атомов вцепи, количеством двойных связей и количеством углеродных атомов между двойной связью и метильной группой (-углеродом) Так, линоленовая кислота обозначается как 18:3ω-3 (омега-3) [17], а, например, линолевая кислота может быть обозначена как С18:2Δ9,12или С18:2ω-6 [6]:123418 17 16 15 14 13 121110 9876 54 3211 3СН2 СН2 СН2 СН2 СН=СН  СН2  СН=СН  СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СH2  CСН конецООНЛинолевая кислота или 18:2  6 (октадекадиеновая кислота)8Таблица 1 – Наиболее распространённые насыщенные ЖКПропановая кислотаБутановая кислотаПентановая кислотаГексановая кислотаГептановая кислотаОктановая кислотаНонановая кислотаДекановая кислотаУндекановая кислотаДодекановая кислотаТридекановая кислотаТетрадекановаякислотаПентадекановаякислотаГексадекановаякислотаГептадекановаякислотаОктадекановая кислотаC2H5COOHC3H7COOHC4H9COOHC5H11COOHC6H13COOHC7H15COOHC8H17COOHC9H19COOHC10H21COOHС11Н23СООНС12Н25СООНРациональнаяполуразвернутаяформулаCH3(CH2)COOHCH3(CH2)2COOHCH3(CH2)3COOHCH3(CH2)4COOHCH3(CH2)5COOHCH3(CH2)6COOHCH3(CH2)7COOHCH3(CH2)8COOHCH3(CH2)9COOHCH3(CH2)10COOHCH3(CH2)11COOHС13Н27СООНCH3(CH2)12COOH53,9 °CС14Н29СООНCH3(CH2)13COOH52 °CС15Н31СООНCH3(CH2)14COOH62,8 °CС16Н33СООНCH3(CH2)15COOH61,3 °CС17Н35СООНCH3(CH2)16COOH69,4 °CНонадекановая кислотаС18Н37СООНCH3(CH2)17COOH68,2 °CЭйкозановая кислотаГенэйкозановаякислотаДокозановая кислотаС19Н39СООНCH3(CH2)18COOH76,2 °CС20Н41СООНCH3(CH2)19COOH75,2 °CС21Н43СООНCH3(CH2)20COOHТрикоциловая кислотаТрикозановая кислотаС22Н45СООНCH3(CH2)21COOH80 °C78,779,1 °CЛигноцериноваякислотаПентакоциловаякислотаТетракозановаякислотаПентакозановаякислотаГексакозановаякислотаГептакозановаякислотаОктакозановая кислотаС23Н47СООНCH3(CH2)22COOHС24Н49СООНCH3(CH2)23COOH7783,5 °CС25Н51СООНCH3(CH2)24COOH87,4 °CС26Н53СООНCH3(CH2)25COOH87,5 °CС27Н55СООНCH3(CH2)26COOH90,9 °CС28Н57СООНCH3(CH2)27COOHС29Н59СООНCH3(CH2)28COOHС30Н61СООНCH3(CH2)29COOHС31Н63СООНCH3(CH2)30COOHС32Н65СООНCH3(CH2)31COOHС33Н67СООНCH3(CH2)32COOHС34Н69СООНCH3(CH2)33COOHС35Н71СООНCH3(CH2)34COOHТривиальное названиеПропионовая кислотаМасляная кислотаВалериановая кислотаКапроновая кислотаЭнантовая кислотаКаприловая кислотаПеларгоновая кислотаКаприновая кислотаУндециловая кислотаЛауриновая кислотаТридециловая кислотаМиристиновая кислотаПентадециловаякислотаПальмитиноваякислотаМаргариновая кислотаСтеариновая кислотаНонадециловаякислотаАрахиновая кислотаГенэйкоциловаякислотаБегеновая кислотаЦеротиновая кислотаГептакоциловаякислотаМонтановая кислотаНонакоциловаякислотаМелиссовая кислотаГентриаконтиловаякислотаЛацериновая кислотаПсилластеариноваякислотаГеддовая(геддинновая) кислотаЦеропластоваякислотаГексатриаконтиловаякислотаСистематическоеназвание (IUPAC)Нонакозановая кислотаТриаконтановаякислотаГентриаконтановаякислотаДотриаконтановаякислотаТритриаконтановаякислотаТетратриаконтановаякислотаПентатриаконтановаякислотаГексатриаконтановаякислотаБрутто формулаТ.пл.−21 °C−8 °C−34,5 °C−4 °C−7,5 °C17 °C12,5 °C31 °C28.6 °C43,2 °C41 °C92-94 °CНасыщенные ЖК, в отличие от ненасыщенных весьма устойчивы к окислению.