Диссертация (Разработка технологии и состава иммунолипосомальной формы митоксантрона с гуманизированными моноклональными антителами к HER-2 антигену)

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯМОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА РОСЗДРАВАНа правах рукописиРАЙКОВ АЛЕКСАНДР ОЛЕГОВИЧРАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СОСТАВАИММУНОЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ МИТОКСАНТРОНА СГУМАНИЗИРОВАННЫМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИАНТИТЕЛАМИ К HER–2 АНТИГЕНУ14.04.01 – Технология получения лекарствДиссертацияна соискание ученой степени кандидата фармацевтических наукНаучный руководитель:доктор фармацевтических наук, профессор И.И. КраснюкМосква – 20162ОглавлениеОглавление ..................................................................................................................................

2Введение ...................................................................................................................................... 5ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 101.1 Митоксантрон ................................................................................................................ 101.1.1 Химические свойства митоксантрона ..................................................................

101.1.2 Механизм действия ................................................................................................ 131.2 Лекарственная форма митоксантрона и особенности ее применения ...................... 141.3 Методы анализа митоксантрона гидрохлорида .......................................................... 161.3.1 Спектрофотометрия в УФ и видимой области спектра ..................................... 171.4 Липосомальные лекарственные формы в настоящее время ......................................

181.4.1 Строение липосом .................................................................................................. 231.4.2 Номенклатура липосом ......................................................................................... 241.4.3 Методы получения липосомальных наночастиц ................................................ 261.4.4 Характеристики липосомальных частиц ............................................................. 361.4.5 Методы активной загрузки ...................................................................................

391.5 Модификации липосом. ................................................................................................ 421.5.1 Пролонгирование циркуляции липосом (ССЛ). ................................................. 421.5.2 Присоединение антител (иммунолипосомы). ..................................................... 431.6 Липосомальные лекарственные формы веществ антрациклинового ряда...............

45ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................. 492.1 Материалы ...................................................................................................................... 492.2 Оборудование ................................................................................................................. 522.3 Методы............................................................................................................................ 552.3.1 Метод получения больших многослойных липосом .......................................... 552.3.2 Метод получения малых однослойных липосом ................................................

552.3.3 Метод получения липосом с инкапсулированным митоксантроном. .............. 562.3.4 Метод получения иммунолипосомальной конструкции митоксантрона ......... 562.3.5 Измерение диаметра везикул ................................................................................

572.3.6 Получение чистой фракции дисперсии с митоксантроном методом гель–фильтрации .................................................................................................................................. 572.3.7 Метод стерилизующей фильтрации везикул с митоксантроном ...................... 582.3.8 Количественное определение инкапсулированного митоксантрона ................ 5832.3.9 Определение белка, связанного с поверхностью липосом с использованиеммедного комплекса бицинхониновой кислоты ........................................................................ 602.3.10 Расчет количества молекул на одну липосому.

................................................ 612.3.11 Метод измерения ζ (дзета) – потенциала липосомальной дисперсии ............ 622.3.12конструкцииМетодоценкимитоксантронаспецифическогоссвязыванияклетками–мишенямииммунолипосомальнойметодомнепрямойреакцииповерхностной иммунофлуоресценции (РИФ) ........................................................................ 632.3.13 Проточно–цитофлуориметрический анализ ......................................................

632.3.14Оценкацитотоксическойактивностилипосомальнойформыииммунолипосомальной конструкции митоксантрона МТТ–тестом in vitro ......................... 64ГЛАВА 3.митоксантронаРазработка состава и технологии получения липосомальной формы663.1 Технология получения липосомальных дисперсий митоксантрона ......................... 663.1.1 Выбор липидных композиций .............................................................................. 673.1.2 Получение больших многослойных липосом (МЛВ) .........................................

693.1.3 Получение малых однослойных липосом (МОЛ) ............................................... 723.1.4 Загрузка препарата ................................................................................................. 763.2 Количественное определение митоксантрона включенного в липосомы. ............... 813.3 Получение иммунолипосомальной конструкции митоксантрона ............................ 833.3.1 Очистка иммунолипосомального митоксантрона .............................................. 853.4Спектрофотометрическоеопределениесодержаниямитоксантронавиммунолипосомальной конструкции ............................................................................................

873.4.1 Определение влияния антител на спектрофотометрические характеристикииммунолипосомального митоксантрона. ................................................................................. 873.5 Определение количества моноклональных антител, связанных с поверхностьюлипосом............................................................................................................................................. 903.6 Лиофилизация липосомального митоксантрона. ....................................................... 913.6.1 Подбор криопротекторов для липосомальной формы митоксантрона.

........... 933.6.2 Изучение влияния способов замораживания. ..................................................... 953.6.3 Изучение влияния процесса сублимации на размер частиц. ............................. 973.6.4 Влияние продолжительности храненения на характеристики липосомальногомитоксантрона. ............................................................................................................................ 983.7 Заключение ...................................................................................................................

1004ГЛАВА 4.Исследование липосомальной и иммунолипосомальной лекарственнойформы препарата in vitro ................................................................................................................... 1034.1 Исследование цитотоксической активности липосомальной формы митоксантронана клетках мишенях.......................................................................................................................

1034.2 Оценка влияния пустых иммунолипосомальных и липосомальных конструкций нацитотоксичность. ........................................................................................................................... 1054.3 Исследование цитотоксической активности иммунолипосомальной формымитоксантрона на клетках мишенях. ........................................................................................... 1074.4 Заключение ................................................................................................................... 111Выводы .................................................................................................................................... 112СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................................

114СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ......................................................... 117Список литературы................................................................................................................. 121ПРИЛОЖЕНИЯ ......................................................................................................................

1355ВведениеАктуальность темы исследованияСогласноданнымвсемирнойорганизацииздравоохранения(ВОЗ)онкологические заболевания являются одной из основных причин заболеваемостии смертности во всем мире. По прогнозам, число случаев заболевания от ракабудет продолжать расти от 14 миллионов в 2012 году до 22 миллионов вследующие десятилетия [133]. В свою очередь, одним из основных методовлеченияонкологическихзаболеванийявляетсяцитостатическаяицитотоксическая химеотерапия, связанная с сильным токсическим воздействиемна различные системы организма пациента и ограниченная дозолимитирующимипобочными эффектами. Необходимость увеличения терапевтического эффектаприменяемых препаратов и снижения побочных эффектов привела к развитиюразличных подходов к применению цитотоксических и цитостатическихлекарственных веществ и достижения избирательности их действия.

Одним изактивно развивающихся направлений стало совершенствование лекарственныхформ с целью обеспечения направленного транспорта биологически активныхвеществ. В результате, было создано множество различных типов наноносителей,одним из которых стали липосомальные и иммунолипосомальные конструкции. Внастоящее время известно, что инкапсулирование цитостатиков в липосомыуменьшает его общетоксическое действие и увеличивает его биодоступность засчет особенностей кровоснабжения опухоли. [4,12,10,33,220,246-247] Пассивнаядоставка противоопухолевых препаратов за счет липосомальных конструкцийреализована в лекарственных препаратах, одобренных для медицинскогоприменения, таких как (Doxil, Myocet, Lipo-dox, DaunoXome) [43,48,49,102,113,116,157,233].Совершенствование механизмов направленного транспорта привело кмодификациилипосомальныхлекарственныхформсиспользованиемиммунохимических векторов и созданию иммунолипосомальных конструкций.Иммунолипосомы – липосомальные конструкции, имеющие на своей поверхности6векторные лиганды, в качестве которых могут выступать факторы роста, пептидыимоноклональныеантитела(МКА).Внастоящеевремяизучениеиммунолипосомальных конструкций является одним из наиболее перспективныхнаправлений развития технологии направленной доставки препаратов.HER-2 положительный рак молочной железы – одно из наиболеераспространенных новообразований и вторая по распространенности причинасмерти у женщин с раком молочной железы [93].