Автореферат (Персонифицированная ранняя диагностика и стратификация рисков прогрессирования туберкулезной инфекции у детей), страница 7

Druszczynska et al., 2017]. Основным недостатком внастоящеевремяявляетсяотсутствиезолотогостандартадиагностикиипрогнозирования заболевания [P. Auguste et al., 2017; WHO, 2018], т.к. ни один изиммунологическихтестовнеобладаетдостаточнойчувствительностьюилиспецифичностью для определения латентной и активной туберкулезной инфекции[WHO, 2018]. Поэтому приоритетной задачей исследований последнего времени29является поиск специфических биомаркеров для оценки всех этапов развития ТБ ивозможности их использования в диагностических тестах [H. Su et al., 2017; D.

Goletti etal., 2018]. С учетом этого задачей следующего этапа нашего исследования являласьоценка значимости туберкулезных антигенов (как хорошо изученных, так и недавноидентифицированных) на разных стадиях развития туберкулезной инфекции у детей.Среди ранее изученных специфических белков МБТ в настоящее время длядальнейшегоисследованияпредставляетинтересESAT6.Низкомолекулярныйсекретируемый белок ESAT6 [H. Yang et al., 2012] кодируется в регионе RD1, которыйприсутствует в M. tuberculosis и M. bovis, но отсутствует в M. bovis BCG. Средифакторов, которые оказывают непосредственное воздействие на организм хозяина дляподавления защитных механизмов, рассматривался именно белок ESAT6 [J.

Dietrich etal., 2015]. По результатам других исследований, данный белок оценивался как раносекретируемый антиген на этапе формирования противотуберкулезного иммунитета, вэкспериментах была доказана его протективная роль [J. S. Woodworth et al., 2014], и, какследствие, его можно было бы считать маркером ЛТИ. В нашем исследовании былодоказано, что специфический белок ESAT6 необходимо рассматривать в качествемаркера ЛТИ на этапе ее раннего развития при первичном инфицировании МБТ. Так,положительные результаты индуцированного ИФН- с ЕSAT6 чаще регистрировалисьсреди детей с ЛТИ, чем среди больных ТБ (р = 0,05). Сохранение ответа на ESAT6 наэтапе развития ТБ свидетельствовало о благоприятном течении заболевания, чтохарактерно было для первичных форм у детей.

При этом, определяя уровеньиндуцированного ИФН- с ESAT6, установили значимые показатели для оценкиРППТИ, индекс стимуляции составил 4,2 ± 0,8, для ТБ показатель был не значим – и.с.1,1 ± 0,1 (U = 4729; р = 0,000).Таким образом, полученные результаты показали, что белок ЕSAT6 значим дляэтапа раннего развития туберкулезной инфекции. Белок ESAT6 является одним из двухосновных компонентов нового диагностического теста (T-SPOT.ТВ; Oxford Immunotec,UK) [H.

Jia et al., 2016], зарегистрированного на территории РФ и рекомендованного вкачестве альтернативного метода диагностики туберкулезной инфекции [Федеральныеклинические рекомендации по диагностике и лечению латентной туберкулезнойинфекции у детей, 2015]. При этом последние исследования показали, что T-SPOT.ТВ недифференцирует латентную и активную туберкулезную инфекцию [H. Jia et al., 2016;30F. Wang et al., 2016; K. L. Chin et al., 2017]. Второй белок, входящий в состав TSPOT.ТВ, – CFP10. Мы в своем исследовании оценивали данные белки в виде гибрида –ЕSAT6-CFP10. Полученные результаты позволили нам говорить об изменении свойствбелка ESAT6 в связанном с CFP10 состоянии и рассматривать данный гибрид дляопределения активной туберкулезной инфекции.

Так, среди детей, больных ТБ,значимым был показатель уровня индуцированного ИФН- с ЕSAT6-CFP10 – и.с.7,3 ± 0,8, для детей с ЛТИ показатель был не значим, в том числе на этапе первичногоинфицирования МБТ (РППТИ) – и.с. 1,2 ± 0,4 (U = 1291,5; р < 0,0001) (рис. 4).109уровень ИФН- Y c ЕSAT6-CFP10, и.с.*876543210Средств о±SE±1,96*SE-1ТБРППТИТПВАподгру ппы срав ненияПТА**Рисунок 4 – Уровень индуцированного ИФН- с ЕSAT6-CFP10 у детей в группахсравнения (и.с.)Примечание: * р = 0,000 (критерий Краскела-Уоллиса),**группы сравнения: ТБ – группа с установленным диагнозом туберкулез; РППТИ – группадетей в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции; Т – группа инфицированных МБТболее года; ПВА – группа с поствакцинальной аллергией; ПТА – группа с положительнойтуберкулиновой анергией.Еще один хорошо изученный специфический белок – 85a – в настоящее времяпредлагается для применения с диагностической целью.

Ранее исследования показали,что антигенный комплекс 85 проявляет высокую перекрестную реактивность сантигенами практически всех МБТ [A. Demissie et al., 2006], это позволяет говорить оего низкой диагностической информативности для ЛТИ. Полученные результатынашего исследования показали, что Ag85a – это белок, характеризующий в первуюочередьлатентнуюстадиютуберкулезнойинфекции,таккакпоказательиндуцированного ИФН- с Ag85а был значим для РППТИ – и.с. 3,0 ± 0,6 (р = 0,0002).31При этом несмотря на большую частоту регистрации положительных результатов удетей с РППТИ (49,2%) (р = 0,0005), выявили положительные показатели и у детей сПВА (17,6%), что, как мы и предполагали, снижало значимость этого белка длядифференциальной диагностики туберкулезной инфекции у детей.Среди недавно идентифицированных белков был выбран один из перспективныхантигенов МБТ – белок Rv2660c, который относится к области RD11 МБТ [L.

Govenderet al., 2010]. Считается, что данный белок может относиться к латентным антигенам[A. M. Salman et al., 2017], хотя его функция в настоящее время до конца не определена[L. Govender et al., 2010]. Поэтому оценка возможности распознавания иммуннымиклетками белка Rv2660c на разных стадиях туберкулезной инфекции позволитрасширить представление о новом антигене. Результаты нашего исследования впервыедают возможность говорить о белке Rv2660c как о маркере ранней стадиитуберкулезной инфекции при первичном инфицировании МБТ. При определении уровняИФН- после индукции Rv2660c у больных ТБ (и.с.

1,6 ± 0,3), у детей с ЛТИ (и.с.3,4 ± 0,5) и у НТ (и.с. 1,0 ± 0,2) были установлены различия (Н = 10,826; р = 0,004) (рис.5).7*уровень ИФН- с Rv2660c, и.с.6543210ТБРППТИТПВАПТАСредств о±SE±1,96*SEгру ппы срав нения **Рисунок 5 – Уровень индуцированного ИФН- с Rv2660c у детей в группах сравнения(и.с.)Примечание: * р = 0,000 (критерий Краскела-Уоллиса)**группы сравнения: ТБ – группа с установленным диагнозом туберкулез; РППТИ – группадетей в раннем периоде первичной туберкулезной инфекции; Т – группа инфицированных МБТболее года; ПВА – группа с поствакцинальной аллергией; ПТА – группа с положительнойтуберкулиновой анергией.32Сравнивая показатели ИФН- после индукции Rv2660c (и.с.) у детей, больных ТБ,в зависимости от генеза заболевания установили достоверные отличия (U = 724,5;р = 0,031) в продукции цитокина при формировании первичных (и.с.

1,9 ± 0,3) ивторичных форм (и.с. 0,8 ± 0,2), что указывало на протективную роль специфическогобелка. Наиболее высокий уровень цитокина после стимуляции Rv2660c выявили наэтапе РППТИ – и.с. 5,1 ± 0,8 (U = 4887; р = 0,000). Также имелась сильная корреляциямежду показателями индуцированного ИФН- с ЕSAT6 и Rv2660c (по Спирмену,r = 0,77, р = 0,000). Таким образом, все это позволяет утверждать, что основная рольбелка связана с ранней стадией развития туберкулезной инфекции и, следовательно,белок Rv2660c, так же как белок ЕSAT6, участвует в формировании адаптивногоиммунитета. А, учитывая, что данные белки не связаны с поствакцинальнымиммунитетом, ЕSAT6 и Rv2660c можно рассматривать в качестве основных антигеновдля диагностики РППТИ.Еще одним из недавно идентифицированных антигенов МБТ является белокCFP32B.

Установлено, что данный белок стимулирует гуморальный ответ [R. C. Huard etal., 2003], поэтому можно предположить его роль в прогрессировании ТБ. При этомпроводимые ранее исследования ограничены и противоречивы, что не позволяетоценить роль белка CFP32B на этапе развития туберкулезной инфекции, такженеобходимо учитывать, что ген данного белка обнаружен и в геноме БЦЖ[C. Benabdesselem et al., 2006].

По результатам наших исследований установлено, чтодля оценки активности туберкулезной инфекции и ее прогрессирования белок CFP32Bмало значим. Дополнительно было установлено, что показатель значим у детей сРППТИ (и.с. 3,5 ± 0,6, U = 4459,5; р = 0,000). При этом ответ на CFP32B сохранялся привакцинации БЦЖ или БЦЖ-М. Так как возможна перекрестная реакция с МБТ, этоснижает диагностическую значимость специфического белка CFP32B. Таким образом,мы впервые идентифицировали белок CFP32B в качестве потенциального маркера дляЛТИ с невысокой диагностической значимостью.Комплексная оценка специфических белков позволила выделить нескольковариантов иммунного ответа по результатам кластерного анализа (рис. 6): первыйвариант (кластер 1) был связан с выраженным ответом на ППД-Л и ЕSAT6-CFP10, атакже слабо выраженным ответом на белки ранней стадии туберкулезной инфекции(ESAT6, Rv2660c, 85а, CFP32B), второй (кластер 2) – с отсутствием ответа на33стимуляцию антигенами, третий (кластер 3) – с выраженным ответом на белки раннейстадии туберкулезной инфекции, слабо выраженным на ППД-Л и отсутствием ответа нагибридный белок.стандартизованные показатели и.с.

индуцированного ИФН-4,54,03,53,02,52,01,51,00,50,0-0,5-1,0-1,5-2,0ППД-ЛRv2660cCFP32B85aESAT6ЕSAT6-CFP10Кластер 1Кластер 2Кластер 3специфические антигеныРисунок 6 – Кластерный анализ по стандартизованным показателям и.с.индуцированного ИФН- специфическими антигенами у детейСредибелковраннейстадиитуберкулезнойинфекциипорезультатамранжирования для ЛТИ были установлены значимые уровни для Rv2660c – R 3,984;ESAT6 – R 3,411, CFP32B – R 3,016 и 85а – R 2,958.

Для ТБ значимым, крометуберкулина, был гибридный белок, при ранжировании для них установленынаибольшие значения среднего ранга R 5,945 и R 4,573 (р < 0,000001), при этом низкийуровень иммунного ответа на специфические белки рассматривался в качестве рисканеблагоприятного течения заболевания (коэффициент риска 1,73; 95% ДИ 1,059–2,828).Вариант регистрации положительного ответа на ЕSAT6-CFP10 у детей с ЛТИ оценивалив качестве риска развития ТБ (коэффициент риска составил 4,047; 95% ДИ 2,797–5,856).Таким образом, мы впервые установили, что белки ЕSAT6, Rv2660c, 85а иCFP32B можно рассматривать в качестве маркеров ЛТИ на ее ранней стадии развития, агибридный белок ЕSAT6-CFP10 – маркера активной туберкулезной инфекции –преимущественно на стадии развития заболевания или высокого риска ТБ.

АнтигеныППД-Л, 85а, CFP32B менее значимы для решения вопросов дифференциальной34диагностики ЛТИ и ПВА, учитывая перекрестную реактивность между БЦЖ и МБТ. Всвязи с этим мы определили в качестве перспективных для оценки ЛТИ два антигена:ЕSAT6 и Rv2660c, для активной – ЕSAT6-CFP10, что позволило рекомендовать их длявключениявспецифическиеиммунологическиетестыпоопределениюиндуцированного ИФН- для диагностики и дифференциальной диагностики латентнойи активной туберкулезной инфекции у детей.При определении индуцированного ИФН- мы предложили количественнуюоценку показателей для возможности использования данных при динамическомнаблюдении. Впервые были определены значимые диагностические критерии поуровню (и.с.) индуцированного ИФН- специфическими антигенами (ППД-Л, ЕSAT6CFP10, ЕSAT6, Rv2660c, 85а и CFP32B) для диагностики ПВА, ЛТИ и ТБ. Для ПВА (длядетей раннего возраста) характерны показатели уровня ИФН- с ППД-Л до 4,0,результат мог сочетаться с положительным (более 1,0) ответом на стимуляцию CFP32Bи 85а.