Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 11

Они были депарафинированы, регидратированы,промыты в дистиллированной воде, инкубированы в метаноле, содержащем0.3% H2O2, снова промыты в дистиллированной воде, затем в 0.05% M Tris-HCl,преинкубированы в молочном буфере Tris (0.05% M Tris-HCl, содержащем 5%молочного порошка) в течение 10 минут и инкубированы с антителами AT8(Cummings et al., 2002) в разведении 1:300 в молочном буфере Tris притемпературе 40 C в течение ночи. На следующий день срезы были промыты вбуфере Tris 3 раза по 10 минут, инкубированы со вторичными антителамикролика, распознающими иммуноглобулины мыши, в разведении 1:100 вмолочном буфере Tris в течение 1 часа при комнатной температуре, промыты вбуфере Tris 3 раза по 10 минут и проявлены в растворе 3',3'- диаминобензидинатетрагидрохлорида, содержащем 0.0001% H2O2 в течение 20 минут, затем60докрашены гематоксилином и эозином в течение 2 минут, промыты впроточной воде в течение 5 минут, дегидратированы и заключены всинтетическую среду.Иммуноцитохимическое окрашивание эстрогенового рецептора Окрашивание эстрогенового рецептора  (Ishunina et al., 2000) былопроведено по следующей схеме 1) депарафинирование в ксилоле и спиртахнисходящей концентрации; 2) споласкивание в дистиллированной воде 2x5мин.; 3) промывание в солевом буфере TBS (pH 7.6) 2x5 мин.; 4) инкубация вводяной бане в 0.05M Tris-HCl буфере (pH 7.6) в течение 30 минут при 90 0C, 5)промывание в TBS 2x5 мин.; 6) инкубация в растворе TBS, содержащеммолочный порошок в течение 1 часа при комнатной температуре; 7)споласкивание в TBS 1x5 мин.; 8) инкубация с первичными поликлональнымикроличьими антителами анти-ЭР, распознающими эпитоп на карбоксильномконце ЭР, в разведении 1: 100 в молочном супермиксе (0.25% желатин, 0.5 млTriton X-100 и 5% раствор молочного порошка в 100 мл TBS, pH 7.6) в течение1 часа при комнатной температуре и при 40C в течение ночи.

На следующийдень срезы были 9) промыты в растворе TBS с молочным порошком 3x10 мин.;10)затемвTBS1x5мин.;11)инкубированысовторичнымибиотинилированными антителами, распознающими IgG кролика в разведении1:200 в молочном супермиксе в течение 1 часа при комнатной температуре; 12)промыты в TBS 3x10 мин.; 13) инкубированы с авидин биотиновымкомплексом (ABC) в разведении 1:800 в супермиксе в течение 1 часа прикомнатной температуре; 14) промыты в 0.05M Tris-HCl (pH 7.6); 15)инкубированы в Tris-HCl, содержащем 0.05% 3,3' диаминобензидина, 0.0001%H2O2 и 0.3% аммониевого сульфата никеля; 16) промыты в Tris-HCl 2x10 мин.;17) дегидратированы в спиртах восходящей концентрации и ксилоле изаключены в среду Entellan.61Иммуноцитохимическое окрашивание эстрогенового рецептора Иммуноцитохимическое выявление ЭР (Ishunina et al., 2000) былопроведено по следующей схеме: 1) депарафинирование в ксилоле и спиртахнисходящей концентрации; 2) споласкивание в дистиллированной воде 2x5мин.; 3) споласкивание в Tris-содержащем концентрированном солевом буфереTBS (pH 7.6) 2x5 мин.; 4) подвержены термической обработке в 0.1Mцитратном буфере (pH 6.0) 2x5 мин.

при 700W в микроволновой печи, 5)промыты в концентрированном TBS 2x5 мин.; 6) инкубированы в молочномTBS в течение 1 часа при комнатной температуре; 7) промыты вконцентрированном TBS 2x10 мин.; 8) инкубированы с первичнымиполиклональными козьими антителами, распознающимиаминокислотнуюпоследовательность N-амино конца ЭР человека в разведении 1:50 всупермиксе (0.25 г.желатина, 0.5 мл Triton X-100 в 100 мл TBS, pH 7.6) втечение 1 часа при комнатной температуре и при 40C в течение ночи.

Наследующий день срезы были 9) промыты в молочном TBS 2x10 мин.; 10) затемв концентрированном TBS 2x5 мин.; 11) инкубированы со вторичнымибиотинилированными антителами, распознающими IgG козы в разведении1:200 в супермиксе в течение 1 часа при комнатной температуре; 12) промыты вмолочном TBS 2x10 мин.; 13) промыты в концентрированном TBS 10 min; 14)инкубированы с авидин-биотиновым комплексом (ABC) в разведении 1:800 всупермиксе при комнатной температуре; 15) промыты в концентрированномTBS 2X10 мин.; 16) инкубированы с биотинилированным тирамином вразведении 1:500 в TBS с 0.01% перекисью водорода (H2O2) в течение 15 минутпри комнатной температуре; 17) промыты в концентрированном TBS 2x10мин.; 18) инкубированы с комплексом ABC как описано выше; 19) промыты в0.05M Tris-HCl (pH 7.6); 20) инкубированы в Tris-HCl, содержащем 0.05% 3,3'диаминобензидина, 0.0001% H2O2 и 0.3% аммониевый сульфат никеля; 21)промыты в Tris-HCl 2x10 мин.; 22) дегидратированы в спиртах восходящейконцентрации и ксилоле и заключены под покровные стёкла в среде Entellan.62Специфичность использованных антител и методов окраски ЭР и ЭРподробно описана ранее.

Интенсивность иммуноцитохимического окрашиванияоценивалась полуколичественно по следующей шкале: +++ (сильная), ++(умеренная), + (слабая), + - (очень слабая) и – (отсутствует).Иммуноцитохимическое окрашивание мутантного белкаУБВ+1Антитела, распознающие мутантный белокпредоставленыдокторомF.VanLeeuwenУБВ+1, были(NetherlandsлюбезноInstituteforNeurosciences), а их специфичность описана в работах (Fischer et al., 2003; VanLeeuwen et al., 1998). Депарафинированные срезы, содержащие ВЯДБ, БЯМ игипоталамические туберомамиллярное (ТМЯ) и медиальное мамиллярное(ММЯ) ядра, инкубировали в растворе этих антител, разведенных 1:400, втечении 1.5 часа при комнатной температуре и при 40 в течении ночи споследующимокрашиваниемпероксидазо-антипероксидазнымметодом.Соседние срезы окрашивались на ЭР авидин биотиновым методом.Иммуноцитохимическое окрашивание ароматазыПоликлональные антитела (Narom/11.03.99) были получены в результатеиммунизациикроликапептидомиз20аминокислот,связанныхстироглобулином посредством глутаральдегида.

Последовательность пептидасоответствует N-терминальной части ароматазы человека. Специфичностьантител проверена с помощью западного блоттинга (Рис. 5). Последепарафинирования, регидратации в спиртах нисходящей концентрации,споласкивания в дистиллированной воде и промывания в Трис-фосфатномбуфере (0.05M Трис и 0.15M NaCl, pH 7.6) (TBS), срезы подвергалисьтермическому воздействию в водяной бане при 900C в течение 20 минут в TBSдля оптимального высвобождения антигена. Срезы были промыты в TBS, затемв течение 15 минут в 1.25% растворе TBS, содержащем молочный порошок,потом снова в TBS, затем инкубированы в 10% растворе лошадиной сывороткив TBS в течение 10 минут для снижения фонового окрашивания. После этого63срезы споласкивались в TBS с последующей инкубацией с антителами антиP450аром, разведенными 1:300 в фосфатном буфере (pH 7.6) в течение 1 часапри комнатной температуре и при 40C в течение ночи.

На следующий деньсрезы промывались в 1.25% молочного TBS и TBS в течение 20 минут, а затеминкубировались с козьей сывороткой, распознающей иммуноглобулиныкролика (AKON) в разведении 1:100 в TBS в течение 1 часа при комнатнойтемпературе, промыты в 1.25% молочного TBS и TBS в течение 20 минут иинкубированыспероксидазо-антипероксидазнымкомплексом(PAP)вразведении 1:1000 в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Вкачествехромогенаиспользовано0.5мг/мл3,3'-диаминобензидина-тетрагидрохлорида.

Усиление окрашивания достигалось добавлением сульфатааммонийного никеля (2.2 мг/мл). Срезы были промыты в TBS 2 раза по 7минут, дегидратированы в спиртах восходящей концентрации и ксилоле изаключены под покровные стёкла в среде Entellan.Количественная оценка иммунореактивности ароматазыИнтенсивностьоцениваласьокрашиванияполуколичественновпонейронахследующейиглиальныхшкале:++++клетках(оченьинтенсивное) +++ (интенсивное), ++ (умеренное), + (слабое), + - (очень слабое)двумя независимыми исследователями, один из которых не имел никакойинформацииобизучаемыхслучаях.Третийэкспертсогласилсясобнаруженными различиями иммунореактивной ароматазы.

Тест Спирманапродемонстрировал статистически значимую корреляцию результатов обоихисследователей (p = 0.0001). Более того, различия значений p не превышали0.001 согласно тесту Манн-Уитни. Неокрашенные нейроны и их ядрышки былихорошо различимы. Идентификация глиальных клеток основывалась наотсутствии ядрышка, небольших размерах клеток, форме и локализации. Наматериале, окрашенном с помощью иммуноцитохимических методов, и назамороженныхсрезах,использованныхдлялазерногомикроиссечения,различия между глиальными клетками установить нелегко.

Поэтому термин64“глиальные клетки” употреблялся без уточнения их разновидностей. В то жевремя, различия между нейронами и глиальными клетками сомнений невызывали. Нейроны крупнее, их перикарионы овальной или полигональнойформы с хорошо заметным ядрышком.Специфичность антител P-450аромПриисключениинаблюдалось.первичныхПреабсорбцияантителпервичнойокрашиванияР-450аромантисывороткинепептидом,использованным для получения антител, в течение 22 часов при 40C привела кполному исчезновению окраски. Более того, при окраске препаратов яичника,яичка и рака молочной железы антисывороткой ароматазы выявленыхарактерныеособенностилокализациииэкспрессииэтогофермента,описанные в литературе у человека и крыс с различными антителами P-450arom(Brodie et al., 2001; Brodie et al., 1997; Carpino et al., 2001; Inkster et al., 1995;Inkster and Brodie, 1991).

В яичнике женщин после менопаузы отсутствовалифолликулы, а иммуноцитохимическое окрашивание ароматазы обнаружено вклетках стромы (Inkster and Brodie, 1991). В яичке иммуноэкспрессия P450аром главным образом выявлена в клетках Лейдига, тогда как всперматоцитах, сперматидах и некоторых сперматогониях она наблюдаласьреже и была слабее. В клетках Сертоли отчётливого иммуноцитохимическогоокрашивания обнаружено не было (Brodie et al., 2001; Carpino et al., 2001;Inkster et al., 1995). В препарате молочной железы ароматаза локализована вэпителиальных клетках терминальных протоков и строме.

В участке молочнойжелезы, поражённом злокачественным новообразованием, фермент Р450аромвыявлен в тех же клетках, но в гораздо большей степени (Brodie et al., 1997). Внастоящейработеразличиявэкспрессииароматазыустановленывгипоталамусе и передне-базальном мозге при старении и болезни Альцгеймера.Приведенные данные вместе с результатами западного блоттинга (описаныниже) демонстрируют специфичность окрашивания ароматазы антителами P450аром.65Западный блоттингГипоталамусы двух пожилых доноров (мужчины 86 лет и 83-летнегопациента с болезнью Альцгеймера), замороженных в жидком азоте ихранившихся при -80oC, были порезаны на срезы толщиной 20 мкм, отступив50 мкм от начала гипоталамического паравентрикулярного ядра, а затемгомогенизированы с помощью ультра-турракса в суспензионном буфере (0.1MNaCl, 0.01M TrisHCl, pH 7.6, 0.001M EDTA, pH 8.0).

Концентрация белковпроводилась в вакуумных условиях на высокой скорости. После этого белкиразделяли путём электрофореза в 10% СДС-полиакриламидном геле при 60 мAв буфере, содержащем 0.025M соли Трис, 0.25M глицина (pH 8.3) и 0.1% SDS.В последующем гель подвергался блоттингу на нитроцеллюлозной мембране (сразмером пор в 0.45 мкм, Schleicher&Schuell, Inc., США) в течение 1 часа при110мA. Нитроцеллюлозные мембраны промывали в супермиксе (0.15M NaCl,0.05M Трис-HCl (pH 7.6), 0.5% Тритона X-100, 0.25% желатина) в течение 30минут. Одну из них затем инкубировали с антителами P-450аром, а другую спреадсорбированнойантисывороткойP-450аром,разведенной1:600всупермиксе при 4oC в течение ночи. На следующий день нитроцеллюлозныемембраны споласкивали в буфере TBS 3 раза по 10 минут, инкубировали совторичными мечеными пероксидазой хрена (DAKO A/S, Дания) антителами,разведенными 1:1000 в супермиксе, в течение 1 часа при комнатнойтемпературе, после чего их споласкивали в TBS 3 раза по 10 минут иинкубировали в растворе Western lightning (PerkinElmer Life Sciences, Inc.,США) в течение 10 минут в темноте.