Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 8

Наиболее популярными среди учёных являются:электрофизиологические методы, определение активности цитохромоксидазы,уровня экспрессии белка и мРНК её субъединиц, изучение интенсивности42экспрессии белка и мРНК c-fos, а также авторадиографический метод дляопределения накопления в мозге 2 деоксиглюкозы.

Для патологоанатомов иморфологических исследований предпочтительны морфометрические, а принеобходимости и иммуноцитохимические методы.Из группы радиографических самой безопасной для пациентов считаетсяфМРТ, позволяющая определять скорость кровотока и объём крови в мозге.Поскольку повышение активности структур мозга сопровождается усилениемих оксигенации за счёт увеличения кровоснабжения, то об изменениях МАмозговых структур можно судить на основании различий их кровенаполнения(Божко и Ахадов, 2006).Позитрон эмиссионная томография (ПЭТ) предоставляет трёхмерныеизображенияфункциональныхпроцессовнаоснованииинтенсивностинакопления в тканях меченого радиоизотопом аналога глюкозы, чаще 2-[18F]фтор-2-деоксиглюкозы.

Однако при этом требуется введение в организмчеловека или животного меченых радиоизотопами биологически активныхмолекул, что сопровождается воздействием на ткани гамма излучения. Внастоящее время ПЭТ комбинируют с компьютерной или магнитнорезонансной томографией (Moore et al., 2000; McGeer et al., 1989). Вэкспериментальных работах аналог этого метода используется давно и известенкак авторадиографический 2-деоксиглюкозный метод. Животным вводитсямеченая радиолигандом 2 деоксиглюкоза (2-ДГ), а после выведения изэксперимента на изготовленные срезы органов помещается специальная плёнкаили эмульсия.

После обработки в фиксаторе и проявителе на плёнке или срезахможно увидеть и количественно оценить интенсивность накопления клетками2-ДГ, достоверно отражающую их метаболическую активность (Konkle et al.,1999). Использование аналогов глюкозы в подобных экспериментах далеко неслучайно. Практически вся энергия в мозге генерируется в процессе аэробногогликолиза.

Полученный в результате АТФ используется для активноготранспорта ионов с целью поддержания потенциала покоя мембраны, для43быстрого аксонального транспорта и для синтеза нейротрансмиттеров (WongRiley, 1989).Ядерно-магнитная резонансная спектроскопия позволяет определять иизучать поведение некоторых атомов, чаще 1Н, в магнитном поле. Маркеры 1Нмагнитно-резонансной спектроскопии (1Н МР) специфично реагируют нанекоторые патологические состояния головного мозга (Schuhmann et al., 2002;Hammen et al., 2007; Jenkins et al., 2000; Najm et al., 1998). Так, например,дисфункцию нейронов или их необратимую гибель можно проследить поизменению уровня N-ацетил-аспартата, который снижается в острой стадиирассеянного склероза и инсульта.

Концентрация лактата при этих состояниях,напротив, возрастает. Это связано с усилением анаэробного гликолиза вишемизированных отделах мозга и активизацией макрофагов вследствиеразрушения клеточных мембран. При этом макрофаги могут использоватьлактат для собственных энергетических потребностей. Снижение креатинина,ещё одного маркера 1Н МР, наблюдается при разрушении ткани мозга ипоявлении очагов с низкой концентрацией клеточных элементов (Mader et al.,2008).C-fos–представительсемейства«immediateearly»генов.Этопротоонкоген, который начинает экспрессироваться в нейронах послепоступления в них ионов Са2+. Возбуждение нейронов приводит к быстрой, новременной индукции c-fos.

Белок, образующийся в результате экспрессии генаc-fos, определяется в нейронах уже через 20-90 минут и исчезает через 4-16часов. Белок c-fos поступает в ядра нейронов и участвует в формированиибелкового комплекса, взаимодействующего с ДНК. По данным электронноймикроскопии, c-fos отсутствует в глиальных, эпендимных и эндотелиальныхклетках (Bullitt, 1990; Szot et al., 2001). Недостатками c-fos как параметра МАнейронов является неспецифическое увеличение экспрессии c-fos послеповеденческих и эмоциональных стрессов. Отдельные структуры мозга могутвообще не экспрессировать c-fos, а некоторые лекарства и средства анестезии44блокируют индукцию c-fos в нейронах (Dragunow and Faull, 1989).

Ввидууказанных особенностей определение c-fos не может использоваться нааутопсийном материале при изучении патологических состояний у человека.Интерес к цитохром оксидазе (ЦО) как маркеру МА нейронов возник в70-х годах прошлого столетия. Уже тогда было показано, что активность ЦО внервных клетках положительно коррелирует с уровнем их функциональнойактивности. ЦО представляет собой интегральный трансмембранный белоквнутренней митохондриальной мембраны, который участвует в последнемэтапе окислительного фосфорилирования и отвечает за потребление 90-95%кислорода в организме. Это конечный фермент в транспортной цепиэлектронов, осуществляющий их передачу от редуцированного субстратаферроцитохрома молекулярному кислороду для образования воды.

При этом врезультате окисления НАДФ происходит образование трёх молекул АТФ.Фермент представлен 6-13 субъединицами. Самые крупные из них (I, II и III)митохондриального происхождения, тогда как все остальные являютсяпродуктамиядерногогеномаихарактеризуютсямежвидовымиимежорганными особенностями (Wong-Riley, 1989; Kish et al., 1992; Simonianand Hyman, 1995). Существует 3 группы методик, позволяющих оценить 1)уровень экспрессии генов, кодирующих различные субъединицы ЦО (in situгибридизация мРНК ЦО) (Gourfinkel-An et al., 2002; Queslati et al., 2005; GomezGallegoetal.,2007),2)экспрессиюферментанауровнебелка(иммуноцитохимическое окрашивание с помощью антител), 3) активность ЦОна срезах (гистохимический метод со спектрофотометрией) (Kish et al., 1992;Nie and Wong-Riley, 1996; Nie et al., 1996; Sakata et al., 2002; Lam et al., 2003).Нарушения окислительного метаболизма в митохондриях являютсянеотъемлимым звеном патогенеза болезни Альцгеймера (БоАл).

При этойформедеменциидегидрогеназногонаблюдаетсякомплекса,серьёзныйнапрямуюдефицитвлияющийнакетоглутаратэнергетическийметаболизм в цикле трикарбоновых кислот (Blass and Gibson, 1991). Данные45компьютерной томографии и ПЭТ продемонстрировали снижение кровотока,утилизации кислорода и метаболизма глюкозы в височной, теменной инекоторых участках лобной коры пациентов с БоАл (McGeer et al., 1989).Гистохимические исследования показали уменьшение активности ЦО ввисочных и лобных отделах коры (Kish et al., 1992) и в СА1 и СА3 поляхгиппокампа (Simonian and Hyman, 1995).

При более детальном молекулярнобиологическом анализе оказалось, что при этом заболевании селективноснижаетсяуровеньэкспрессиимитохондриальногогена,кодирующегосубъединицу II, тогда как различий в экспрессии субъединицы IV, кодируемойгеном, локализованном в ядре клетки, не установлено (Simonian and Hyman,1995). Приведенные данные свидетельствуют о том, что структуры головногомозга, наиболее сильно поражающиеся при БоАл, характеризуются большейчувствительностью к нарушениям окислительных процессов. Не исключено,что изменения окислительного метаболизма могут способствовать накоплениюв мозге нейрофибриллярных клубков и амилоидных бляшек и влиять на синтезнейротрансмиттеров и ацетилхолина в частности (Blass and Gibson, 1991).Нарушения окислительного метаболизма встречаются и при другихнейродегенеративных заболеваниях.

Так, активность ЦО и экспрессия мРНКмитохондриального гена субъединицы 1 ЦО снижаются в хвостатом ядре,бледном шаре и покрышке при болезни Хантингтона (Browne et al., 1997;Gourfinkel-An et al., 2002).По данным многих исследователей, размеры АГ и гистохимическиймаркер АГ тиамин пирофосфатаза отражают изменения синтетическойактивности нейронов в различных структурах мозга и при различныхпатологиях независимо от метода исследования, будь то определениеферментного маркера, иммуноцитохимическая реакция с использованиемантител или электронная микроскопия (Jongkind and Swaab, 1967; Swaab andJongkind, 1971; Swaab et al., 1971; Gibson et al., 1988; Croul et al., 1990;Mourelatos et al., 1993; Raghavendra Rao et al., 1993; Lucassen et al., 1994; Ruela et46al., 1994; Salehi et al., 1994; Salehi et al., 1995a,b; Dal Canto, 1996; Stieber et al.,1996; Gonatas et al., 1998; Stieber et al., 1998; Swaab et al., 1998; Ishunina et al.,1999).

АГ принадлежит ключевая роль в обеспечении внутриклеточноготранспорта, переработки и модификации секреторных продуктов, белковплазмалеммы и ферментов лизосом (Gonatas et al., 2006). Уменьшение размеровАГ нейронов, ассоциирующееся со снижением секреторной активности, былоописано у пациентов с БоАл в холинэргическом базальном ядре Мейнерта(Salehietal.,1994),гипоталамическомгистаминэргическомтуберомамиллярном ядре (Salehi et al., 1995a) и гиппокампе (Salehi et al., 1995b;Stieber et al., 1996). В этих структурах мозга, участвующих в регуляциипознавательных функций, при деменции Альцгеймеровского типа наблюдаютсязначительные скопления гиперфосфорилированного тау и амилоидных бляшек(Swaab et al., 2003).Из описанных методов оценки метаболической активности нейронов длягистологических срезов посмертного материала мозга человека целесообразныопределение размеров перикарионов нейронов и аппарата Гольджи.47МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫИсследования проведены на посмертном материале мозга 95 человек,предоставленном Нидерландским Банка мозга при наличии соответствующегоразрешения на аутопсию мозга и использование ткани мозга и медицинскойинформации в научных целях.

У контрольных случаев признаков когнитивныхнарушений, неврологических и психиатрических расстройств обнаружено небыло. По данным вскрытия в этой когорте отсутствовали изменения, которыемогли бы быть отнесены к какой-либо патологии мозга. Эту группу разделилина подгруппы с учётом среднего возраста наступления менопаузы у женщин иначала снижения уровня тестостерона у мужчин, составляющего в среднем 5060 лет (Petanceska et al., 2000; Prelevic and Jacobs, 1997; Schneider et al., 1997;Shughrue et al., 1997). Диагноз болезни Альцгеймера был поставлен приисключении других возможных причин деменции на основании историиболезни, медицинского обследования и лабораторных тестов согласнокритериям Национального Института Неврологических и КоммуникационныхРасстройств и Ассоциации по изучению Инсультов, болезни Альцгеймера изаболеваний, имеющих к ним отношение (NINCDS-ADRDA) (McKhann et al.,1984).

Степень тяжести деменции оценивалась по шкале Рейсберга (Reisberg etal., 1982). Клинический диагноз болезни Альцгеймера был подтвержденнейропатологическим исследованием, в результате которого у случаев сболезнью Альцгеймера обнаружены множественные сенильные бляшки,нейрофибриллярные клубки и дистрофичные нейриты в новой коре игиппокампе.Нейропатологсистематическиизучилраспределениенейропатологических проявлений в мозге при БоАл и определил ихвыраженность по шкале от 0 до 6 согласно классификации Браак (Braak andBraak, 1991). У пациентов с БоАл степень распространенности НФК в мозге пошкале Браак составила 5-6, а у контрольных случаев 0-1 (Таблицы всоответствующих разделах).48Участки передне-базального мозга и гипоталамуса, содержащие базальноеядро Мейнерта (БЯМ), вертикальное ядро диагонального поля Брока (ВЯДБ),супраоптическоеядро(СОЯ),инфундибулярноеядро(ИНФ),вентромедиальное ядро (ВМЯ), туберомамиллярное ядро (ТМЯ) и медиальноемамиллярное ядро (ММЯ), были зафиксированы в 4% растворе формальдегидав фосфатном буфере (pH 7.4) при комнатной температуре, дегидратированы вспиртах восходящей концентрации, залиты в парафин и порезаны на серийныефронтальные срезы толщиной 6 мкм.