Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 10

Определялись двавзаимно перпендикулярных диаметра перикарионов нейронов, содержащихядрышко, после чего объём их цитосом высчитывали по формуле аb2/6, где«а» – наибольший, а «b» – наименьший диаметры (Автандилов, 1990; БлинковС.М., Глезер И.И., 1964). Количество нейронов и глиальных клеток в полезрения (в среднем 24 для каждого случая) при увеличении окуляра в 15 раз иобъектива в 40 раз подсчитывалось на всех серийных срезах (каждый 100-ый),содержащих БЯМ, в ростро-каудальном направлении. При этом учитывалосьмаксимальное число полей зрения (в среднем 3-6), покрывающих БЯМ накаждом фронтальном срезе. Нейроглиальный индекс вычислялся путём деленияпоказателейплотностиглиальныхклетокнаплотностьнейронов.Статистическая достоверность различий определялась по значению t критерияСтьюдента.

Подсчёт плотности нейронов и глиальных клеток с последующимопределениемнейроглиальногоиндексапроизводилсянетольковхолинэргическом БЯМ, но также и в ядрах гипоталамуса (СОЯ, ТМЯ и ММЯ)пациентов с СС и соответствующих им по полу и возрасту контрольных55случаев. Более того, для сравнительной оценки двух типов деменциианалогичные показатели цитоархитектоники в БЯМ, СОЯ, ТМЯ и ММЯопределялись в группе лиц с БоАл (7 случаев) и соответствующих им по полу ивозрасту контрольных случаев.ИммуноцитохимияОкрашивание аппарата ГольджиДляиммуноцитохимическогоиспользовалисьполиклональныеокрашиванияантитела,аппаратаполученныевГольджирезультатеиммунизации кролика пептидом HG-130, сиалогликопротеином среднейцистерны аппарата Гольджи (АГ) нейронов человека (130 кДа). Последепарафинирования, регидратации в спиртах нисходящей концентрации,споласкивания в дистиллированной воде и промывания в Трис-фосфатномбуфере (0.05M Tris and 0.15M NaCl, pH 7.6) (TBS), срезы помещались вмикроволновую печь при температуре 900C дважды по 5 минут в 1% раствореZnSO4 для оптимального высвобождения антигена HG-130.

Затем срезысполаскивали в дистиллированной воде, промывали в буфере TBS в течение 10минут, инкубировали в TBS, содержащем 5% молочного порошка в течение 1часа, споласкивали в TBS, инкубировали в 10% растворе лошадиной сывороткив течение 10 минут для исключения фонового окрашивания, споласкивали вTBS и инкубировали с первичными антителами (анти-HG-130), разведенными1:1000 в фосфатном буфере (pH 7.6), в течение 1.5 часов при комнатнойтемпературе и в течение ночи при 40C. На следующий день срезы промывали врастворе TBS два раза по 7 минут и инкубировали с козьей сывороткой AKON,распознающей иммуноглобулины кролика, в разведении 1:100 в TBS в течение1 часа при комнатной температуре, затем снова споласкивали в TBS дважды по7 минут, инкубировали с пероксидазо-антипероксидазным комплексом (ПАП) вразведении 1:1000 в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре исполаскивали в TBS.

В качестве хромогена использован 3',3'-диаминобензидинатетрагидрохлоридвраствореTBS,содержащемперекисьводорода.56Интенсификация окраски достигнута добавлением сульфата аммонийногоникеля. После проявления срезы споласкивались в TBS дважды по 7 минут,затем были дегидратированы в спиртах восходящей концентрации и ксилоле изаключены в синтетической среде «Entellan».Специфичность антител HG-130Поликлональные антитела, распознающие 18 аминокислот специфичногосиалогликопротеина аппарата Гольджи человека (Croul et al., 1990; Gonatas etal., 1989), присоединённых к тироглобулину посредством глутаральдегида,были получены через 7 месяцев после иммунизации, и оказались аналогичнымиранее использованным MG-160 (Ishunina et al., 1999; Lucassen et al., 1993;Lucassen et al., 1994; Salehi et al., 1994; Salehi et al., 1995a; Salehi et al., 1995b).Для подтверждения специфичности новых антител HG-130 выполненыследующие тесты: соседние срезы гипоталамуса человека окрашивались 1)один новыми антителами HG-130, а другой – хорошо провереннымиантителами MG-160; 2) один антителами HG-130, а другой – преиммуннойсывороткой.

Окрашивание новыми антителами HG-130 было идентичным MG160. С помощью обоих антител аппарат Гольджи выявлен в гипоталамическихнейронах в виде характерного гранулярного цитоплазматического окрашиваниявокруг ядра. Локализация иммуноцитохимического окрашивания в аппаратеГольджи (АГ), а не в эндоплазматической сети была отдифференцирована подсветовым микроскопом. Так, в супраоптическом ядре, с помощью антител HG130окрашивалсяоколоядерныйучасток,соответствующийместурасположения АГ, тогда как в периферической части цитоплазмы, гделокализуетсяэндоплазматическаясеть,окрашиванияненаблюдалось.Иммуноцитохимического окрашивания не выявлено и при использованиипреиммунной сыворотки.

Дополнительно проведен западный блоттинг.Западный блоттинг для HG-130Для проведения западного блоттинга фрагменты лобных извилин отразличных случаев, полученные в рамках работы Нидерландского Банка Мозга,57были быстро заморожены в жидком азоте и хранились при температуре -80oC.Кусочки лобной извилины объёмом приблизительно 1 mm3 помещались в 500мкл суспензионного буфера (0.1M NaCl, 0.01M Tris-HCl, 0.001M EDTA (pH8.0), 100 мкг/мл фенилметилсульфонил фторида, леупептин (10 мкг/мл)) впластиковые пробирки. Ткань мозга гомогенизировали с помощью ультратурракса и центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 14000rpm при4oC. 15 мкл полученной жидкости перемешивали с равным объёмом буфера,состоящего из (0.01M Tris-HCl (pH 6.8), 0.02M DTT, 4% SDS, 0.2% голубогобромофенола, 20% глицерин), кипятили в течение 5 минут, помещали в 7.5%SDS полиакриламидный гель, который подвергался электрофорезу при 30мA,250 Ватт в буфере, содержащем (0.025M Tris, 0.25M глицина (pH 8.3), 0.1%SDS).

По завершении электрофореза осуществлялся блоттинг геля нанитроцеллюлозную бумагу (размер пор 0.45 мкм) в течение 1 часа при 100мA,100Вольт, 250 Ватт. Используемые при этом кусочки фильтровальной бумагибыли пропитаны в Тоуниновском буфере (содержит 0.025M Tris-HCl, 0.2Mглицина, 20% метанола). Нитроцеллюлозные бумаги инкубировались наводяной бане при температуре 95oC в течение 10 минут, споласкивались всупермиксе (состоит из 0.15M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.6), 0.5% Тритона X100, 0.25% желатина) в течение 10 минут, инкубировались с антителами HG130 в разведении 1:1000 в течение 1 часа при комнатной температуре споследующей инкубацией при температуре 4oC в течение ночи).

На следующийдень нитроцеллюлозные бумаги споласкивали в супермиксе 2 раза в течение 10минут, инкубировали со вторичными антителами свиньи, распознающимииммуноглобулины кролика в разведении 1:1000 в супермиксе, в течение 1 часапри комнатной температуре, споласкивали в буфере TBST (содержит 0.15MNaCl, 0.065M Tris-HCl (pH 7.5), 0.05%Tween) два раза по 10 минут иинкубировали в растворе субстрата западного блоттинга «Lumi Light» втемноте в течение 5 минут.58Для распознавания окраски на нитроцеллюлозные бумаги помещалиспециальную хемолюминесцентную плёнку, которую спустя две минутыпроявляли в растворе D-19 (Kodak) в течение 4-х минут, споласкивали впроточной воде и фиксировали в максфиксе (Kodak).

На проявленной плёнкевыявлено три полосы (Рис. 4). Полоса, соответствующая размеру 130 кД,принадлежит белку HG-130 АГ, полоса 68 кД соответствует размеру вторичныхантител, что подтверждено отдельным окрашиванием без первичных антител(Рис. 4В), тогда как полоса 50 кДа выявлена при окраске преиммуннойсывороткой (Рис. 4С). Следует отметить, что окрашивания преиммуннойсывороткой в парафиновых срезах не обнаружено, так что ни вторичныеантитела, ни преиммунная сыворотка в изучаемом материале неспецифическойиммуноцитохимической реакции не дают.Рис 4. A) Западный блоттинг для HG-130: полоса 130 kD соответствует белкуHG-130 средней цистерны АГ; B) полоса 68 kD образована вторичными антителами;C) полоса 50 kD обусловлена преиммунной сывороткой.Иммуноцитохимическое окрашивание соматостатинаДля точного определения анатомических границ вентромедиального ядрабыло проведено иммуноцитохимическое окрашивание соматостатина (Timmerset al., 1996) согласно следующему протоколу: после депарафинирования ирегидратации срезы промывались в растворе TBS, кипятились в микроволновойпечи при 700 W 2 раза в течение 5 минут в 0.05M цитратном буфере (pH 4.0),охлаждались до комнатной температуры в течение 20 минут, промывались вTBS, пре-инкубировались в растворе TBS, содержащем 5% молочного порошка59(pH 7.6) в течение 1 часа и инкубировались с поликлональными кроличьимиантителами, распознающими соматостатин 1-12 (S320) в разведении 1:500 всупермиксе (0.25% желатин, 0.5% Тритон-X в 5% растворе молочного TBS, pH7.6) в течение 1 часа при комнатной температуре и при 40 в течение ночи.

Наследующий день срезы промывались в 5% растворе молочного TBS (pH 7.6),инкубировалисьсовторичнымиантителамикозы,распознающимииммуноглобулины кролика (в разведении 1:100 в супермиксе) в течение 1 часа,снова промывались в 5% растворе молочного TBS, инкубировались стретичными антителами PAP в разведении 1:1000 в супермиксе в течение 30минут, промывались в 0.1M буфере Tris-HCl (pH 7.6), затем инкубировались вTBS, содержащем 3-3'-диаминобензидин, 0.01% H2O2 и 0.3% сульфатааммонийного никеля, дегидратировались в спиртах восходящей концентрациии ксилоле, после чего были заключены под покровные стёкла в среде Entellan.Иммуноцитохимическое окрашивание нейрофибриллярных клубковДля определения гиперфосфорилированного тау (AT8) (Cummings et al.,2002), использовались срезы базального ядра Мейнерта и супраоптическогоядра, соседние окрашенным антителами, распознающими аппарат Гольджи иэстрогеновые рецепторы.