Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 13

Ауторадиографическое проявление проведено путём экспозиции навысокочувствительной плёнке Biomax MR-1 в течение ночи. Затем срезыбылипогруженывэмульсию,разведеннуювпропорции1:1дистиллированной водой при 420C (NTB2), высушены в течение 1 часа,выдержаны в течение 3 дней, проявлены, зафиксированы и промыты в водепри температуре 150C, затем докрашены тионином, дегидратированы изаключены пол покровные стёкла в среде Entellan. Для подтвержденияспецифичности пробы два среза от разных случаев, содержащих СОЯ, былиинкубированыспробой,последовательностькоторойидентичнасоответствующей последовательности мРНК вазопрессина.

В этом случае,как и ожидалось, проявлений гибридизации обнаружено не было.Компьютерный анализИзмерения площади сечения перикарионов и аппарата ГольджиИзмерение площади сечения АГ в нейронах (не менее 112.89.1 клетокна случай) было произведено с помощью системы IBAS-KAT (Lucassen et al.,751994; Salehi et al., 1994). Система анализа изображений была присоединена кчёрно-белой камере SONY XC-77CE, помещённой на микроскоп Zeiss.На каждом анализируемом срезе под объективом х2.5 определялиучасток с изучаемым ядром, контур которого затем обводился вручную ивводился в память IBAS с учётом соответствующих координат X-Yсканирующейплощадки.Затемнаобластьядраавтоматическинабрасывалась сетка из квадратов. Причём площадь каждого квадратасоответствовала размеру изображения под объективом х40.

Из этой сеткиавтоматически выбиралось 15 участков (0.95 мм2), которые вводились впамять компьютера при увеличении в 40 раз. Участки, содержащиеиммунореактивное вещество АГ, покрывались маской. Затем подсчитываласьобщая площадь всех сегментов АГ в отобранных квадратах. Каждый из этихквадратов (1948x1298мкм) повторно воспроизводился под программнымконтролем, и все профили нейронов, содержащих ядрышки, обводилисьвручную для определения размеров клеток. Обведённые контуры нейроновсохранялись в памяти компьютера вместе с маской АГ для каждого из них.На заключительном этапе измерялась площадь АГ для каждого нейрона.Следует отметить, что неокрашенные нейроны и их ядрышки былихорошо различимы.

Глиальные клетки в анализ включены не были.Определениепроцентногосодержаниянейроновсядернойигипоталамическихицитоплазматической локализацией эстрогеновых нейроновПропорциональноехолинэргическихядер,содержаниесодержащихнейроновядрышко,сядернымиилицитоплазматическими эстрогеновыми рецепторами  и , либо не содежащихЭР или ЭР, определяли с помощью такой же компьютерной системыанализа изображений (Ishunina et al., 2000), присоединённой к чёрно-белойкамере SONY CCD на микроскопе Zeiss. В каждом срезе определялисьграницы контура ядра (под увеличением микроскопа 2.5), которыезагружались в память компьютера и выводились на дисплей монитора.Положение среза под микроскопом определялось трёхмерной системой76координат X-Y-Z сканирующей площадки.

На этом изображении контур ядраобводился вручную, чтобы исключить клетки, не принадлежащие этомуядру. Под объективом х40 (что соответствовало увеличению в 500 раз) наобласть ядра набрасывалась сетка, состоявшая из квадратов одинаковойвеличины. Положение каждого микроскопического поля определялоськоординатами X-Y-Z сканирующей площадки. На основании этих координаткаждое поле извлекалось из памяти для последующих измерений. Дляопределенияколичестваклеток,экспрессирующихядерныеицитоплазматические ЭР и ЭР, на микроскопе вновь устанавливалсяобъектив 40x, а сканирующая площадка занимала положение, определяемоеранее установленными координатами.

Следует отметить, что неокрашенныенейроны (их перикарионы, ядра и ядрышки) были хорошо различимы насрезах. По окончании количественного анализа подсчитывался процентклеток с различным типом окрашивания (ядерные, цитоплазматические).Статистические тестыНормальное распределение данных изучалось с помощью тестовКолмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Различия площади сечения АГ иперикарионов нейронов, а также процентное содержание клеток с ядерным ицитоплазматическим типом окрашивания эстрогеновых рецепторов междумужчинами и женщинами в различных возрастных группах и у пациентов сБоАл и СС оценивались с помощью одно- и двухфакторного теста ANOVA, атакжеспомощьютестовКрускалла-УоллисаиМанн-Уитни.Дляопределения корреляции изучаемых показателей с различными параметрами,такими как длительность фиксации, промежуток между моментом смерти ивзятием материала, возраст, пол, генотипAPOE, наличие болезниАльцгеймера, использовался анализ линейной регрессии.

Значение p < 0.05считалось достоверным.77РЕЗУЛЬТАТЫЦитоархитектоника ядер передне-базального мозга и гипоталамуса пристарении и болезни Альцгеймера.Вертикальное ядро диагонального поля Брока.АГ (аппарат Гольджи)В результате иммуноцитохимической реакции АГ в ВЯДБ выявлен ввиде околоядерного гранулярного окрашивания в цитоплазме, совпадающегос обычной локализацией этой органеллы в клетке. При предварительномисследовании с помощью световой микроскопии явных половых ивозрастных различий в интенсивности окраски АГ в контрольной группе невыявлено, тогда как при БоАл АГ окрашивался более интенсивно, чем вконтрольной группе, особенно в возрасте до 70 лет.

Последующаяколичественная оценка размеров АГ производилась в двух группах: 1) тольков контрольной группе на предмет возможных половых и возрастныхособенностей (Таблица 5) и 2) в двух группах случаев с БоАл исоответствующих им по возрасту пожилых контрольных случаев дляизучения влияния БоАл (Таблица 6).

Согласно анализу линейной регрессиини длительность фиксации, ни промежуток между моментом смерти ивзятием материала не влияли на размер АГ и площадь перикарионов.Цитоархитектоника ВЯДБ у контрольных случаевПо результатам тестов ANOVA и Kruskal-Wallis статистическидостоверных отличий площади АГ и перикарионов нейронов среди четырёхгрупп контрольных случаев, разделенных по полу и возрасту 50 лет намолодых мужчин, молодых женщин (≤ 50 лет), пожилых мужчин, пожилыхженщин (> 50 лет), обнаружено не было (Таблица 5). Отсутствовала икорреляция указанных параметров с возрастом у мужчин и женщинконтрольной группы.

У пожилых контрольных случаев (> 50 лет) отмеченозначительное увеличение размеров АГ при старении (r = 0.814; p = 0.002).При этом по данным ANOVA и линейной регрессии генотип APOE не влиял78на размеры АГ и перикарионов нейронов ВЯДБ контрольных случаев. Приразделении контрольных случаев согласно классификации ВОЗ, увеличениеАГ наблюдалось в 4-ой возрастной группе (старческий возраст) (р = 0.007)(Рис. 6). Размеры перикарионов нейронов ВЯДБ также были выше в 4-ойгруппе по сравнению с первой (р = 0.011) и третьей (р = 0.049) (Рис.

7).Таблица 5Площадь аппарата Гольджи и перикарионов нейронов в нейронах вертикальногоядра диагонального поля Брока у контрольных случаяев при старенииВозраст  50Мужчины ЖенщиныПолЧисло случаев5Площадь АГ, мкм231.34.91Возраст > 50МужчиныЖенщины75618.13.5122.54.024.53.5271.326.7266.533.8Площадь перикариона, мкм2 260.239.5 245.342.2p = 0.048.Площадь АГ, мкм 212512,6108,312314,34201510502030405060708090возрастРис. 6. График, демонстрирующий площадь АГ в нейронах вертикального ядрадиагонального поля Брока ВЯДБ в возрастных группах ВОЗ (.1 – молодые, 25-44г., 2 –средний возраст, 45-59 лет, 3 – пожилые, 60-74г., 4 – старческий возраст, 75-80 лет)Индивидуальные показатели отмечены чёрными ромбами.

Средние значения для каждойгруппы показаны во встроенной столбчатой диаграмме.79площадь перикарионов45040035030025020015020726722230512341005002030405060708090возрастРис. 7. Площадь (в квадратных микрометрах) перикарионов нейронов в вертикальномядре диагонального поля Брока (ВЯДБ). Индивидуальные значения для каждого случаяотмечены ромбами. Встроенная столбчатая диаграмма демонстрирует средние значения(указаны над каждым столбцом) показателя в четырёх возрастных группах ВОЗ (1 –молодые, 25-44 лет; 2 – средний возраст, 45-59 лет; 3 – пожилые, 60-74 года; 4 старческий возраст, 75-89 лет).Метаболическая активность нейронов ВЯДБ у пациентов с БоАлНаблюдалась отчётливая тенденция к увеличению АГ у людей с БоАлпо сравнению с контрольными случаями (ME: F(1;21) = 3.508; p = 0.077)(Таблица 6, Рис. 8).Таблица 6Площадь АГ и перикарионов нейронов в ВЯДБ пациентов с БоАлгруппа с БоАлконтрольные случаиКоличество1011Площадь АГ, мкм230.82.9123.62.51Площадь перикарионов, мкм2312.321.1268.716.01p = 0.077.Этот эффект оказался ещё более значительным при разделении второйэкспериментальной группы с учётом возраста 70 лет: (ME (главный эффект):F(2;21) = 3.820 (БоАл) и = 1.521 (возраст 70 лет), p = 0.067 и p = 0.234соответственно; IE (эффект взаимодействия двух факторов, влияющий наизучаемый показатель) между БоАл и возрастом 70 лет: F(1;21) = 5.612; p =800.030).