Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 12

Для выявления окраски нанитроцеллюлозные листы на 2 минуты помещалась светочувствительнаяплёнка Lumi Chemiluminescent Detection Film (Boehringer, Mannheim), которуюсразу проявляли в проявителе D-19 (Kodak) в течение 25-60 секунд,споласкивали в проточной воде и фиксировали в Maxfix (Kodak) в течение 15минут. На нитроцеллюлозном листе, инкубированном с антителами P-450аром,иммунореактивная полоса соответствовала молекулярному весу 55 кДа, что66характерно для белка ароматазы человека P-450 (Osawa et al., 1987).

Спреадсорбированными антителами иммунореактивности при 55кДа выявленоне было (Рис. 5).Количественная цепная реакция полимеразы для выявления мРНК ароматазымРНК Р-450аром определяли с помощью цепной реакции полимеразы(ЦПР). После короткого окрашивания гематоксилином и дегидратации вспиртах, площадь БЯМ (1.93 мм2), ТМЯ (0.63 мм2), 113 нейронов БЯМ, 133глиальные клетки БЯМ и 100 нейронов ТМЯ были изолированы из 5замороженных срезов гипоталамуса мужчины 81 года посредством лазерногомикроиссечения. РНК экстрагировали с помощью реагента «Тризол» согласноинструкции производителя. Копии ДНК (кДНК) получены с помощью обратнойтранскриптазы «Суперскрипт III».

ЦПР проводились в объёме 20 мкл,содержащем i) реагенты набора SYBR Green PCR, ii) полученные кДНК и iii)прямой: 5’- TGCAGGAAAGTACATCGCCAT - 3’ (нуклеотиды 126-146) иобратный: 5’- TCCTTGCAATGTCTTCACGTG - 3’ (нуклеотиды 210-190)праймеры, специфично распознающие экзон 10 гена ароматазы (номер GenBankM3 0804 J05105), созданные с использованием программы “Экспресс праймер”.Реакции ЦПР проводились в Системном блоке GeneAmp 5700.

Посленачального денатурирования при 950C в течение 10 минут следовало 40 циклов:15 секунд при 950C и 1 минута при 600C. Произведены следующие контрольныереакции: 1) ЦПР без ДНК субстрата отрицательна, 2) ЦПР с кДНК, полученнойот клеточной линии нейробластомы IMR-32 (Yasuhara et al., 1997) спраймерами,распознающимиCATGATTTGAGAAGCCTTCGCген-COX-1:3’ипрямойобратный5’–5’-CGAATGTGTGGTAGGGTGGG - 3’ (реакция положительна на 16-ом цикле) и3) ЦПР с полученными кДНК и праймерами, распознающими ген COX-1 (цикл< 33).

Все реакции проводились два раза.67Рис. 5. Иммунореактивные полосы, соответствующие белковой фракции ароматазы смолекулярным весом 55 кДА, выявлены в экстрактах паравентрикулярного ядра у обоихслучаев (А 1 и 2). После преадсорбции антител к комплементарному пептидуиммуноцитохимическое окрашивание отсутствует (В 1 и 2).68Молекулярно-биологическое исследование мамиллярных телИзоляция РНК и синтез кДНКМамиллярные тела (МТ) были вырезаны из замороженных гипоталамусов5 контрольных и 5 случаев с болезнью Альцгеймера стерильным лезвием(новым для каждого случая).

РНК от МТ каждого случая была экстрагирована спомощьюреактива«Тризол»согласноинструкциямпроизводителя.Концентрации РНК определялись при спектрофотометрии. Реакции обратнойтранскрипции (ОТ) проведены для каждого случая с 1.5г РНК и смесьюгексануклеотидов. РНК нагревалась до 700C в течении 10 минут, затемохлаждалась на льду и смешивалась с буфером 5x first-strand, 100mM DTT,10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP и 1мкл ингибитора рибонуклеазы. Реакции ОТпроведены с 200 единицами обратной транскриптазы «Суперскрипт II» вобъёме 20мкл в течение 90 минут при 420C.Цепная реакция полимеразы (ЦПР)2мкл копированной ДНК были использованы в качестве исходногоматериала для амплификации фрагментов 1) от первого до четвёртого экзона(Таблица 3); 2) от четвёртого до восьмого экзона (Таблица 3); 3) от второго допятого экзона (Таблица 3); 4) от второго до четвёртого экзона (Таблица 3); 5) оттретьего до пятого экзона (Таблица 3).

ЦПР проведены в объёме 50мкл,содержащем праймеры (Таблица 2), 0.25mM dNTPs, буфер супертак, 1.5mMMgCl2 и 5 единиц ДНК полимеразы «Так». Оптимальные условия дляамплификации были следующими: начальная денатурация при 940C в течениедвух минут, 36 циклов, включающих денатурацию при 940C в течение 20секунд, гибридизацию праймеров при 520C в течении 30 секунд и распрямлениепри 720C в течение двух минут; затем конечное распрямление при 72 0C втечение семи минут. В отсутствии кДНК (контроль со стерильной водой) ЦПРвсегда были отрицательными.

Дополнительный внутренний и негативныйконтроль с отсутствием обратной транскриптазы не проводились, так какнуклеотидная последовательность всех обнаруженных продуктов ЦПР не69содержала интронов. Продукты ЦПР помещались в 2% агарозный гель,окрашенный бромидом этидия, с последующим электрофорезом при 80V ивизуализацией в ультрафиолетовом свете. Отчётливо окрашенные полоскивырезались из геля стерильным лезвием с дальнейшим выделением из нихДНК. Очищенная ДНК подвергалась ре-амплификации при тех же условиях сопределением нуклеотидной последовательности (Ewing et al., 1998).Количественная ЦПРИсходя из полученных последовательностей, были созданы новыекомбинации праймеров для количественной оценки фрагментов кДНК ЭРменьшей длины: 1) классической мРНК ЭР (транскрипты, кодирующиеинтактные домены для связывания с лигандами (экзон 7) и ДНК (экзон 2)), 2)сплайсинговых вариантов ЭР с выпадением седьмого (э7) и второго (э2)экзона (Таблица 4).

Во всех указанных парах праймеров, за исключениемсвязывающей седьмой и восьмой экзоны, один из праймеров находился точно вобласти контакта экзонов. Для нормализации использовались следующиереферентныегеныипраймеры:рибосомальныйбелокS27a(rS27a)(GGTTAAGCTGGCTGTCCTGAA и AGAAGGGCACTCTCGACGAA), факторвыпрямления1(EF1)(AAGCTGGAAGATGGCCCTAAAиAAGCGACCCAAAGGTGGAT) и E2D 2 убиквитин-конъюгирующий ферментUbe2d2(CTGAAGAGAATCCACAAGGAATTGAиCTCCAACAGGACCTGCTGAAC).

Количественные ЦПР проведены в объёме20мкл, содержащем 0.1мкл кДНК и раствор для ЦПР с флюоресцентнымкрасителем «SYBR Green» по следующей схеме: начальная денатурация при950C в течение 10 минут и 40 циклов: 15 секунд при 95 0C и 1 минута при 600C.Все реакции проведены дважды.

При замещении кДНК стерильной водой ЦПРбыли отрицательными для каждой пары праймеров.70Таблица 3Праймеры для ЦПРФрагментНаправление Последовательность1) от экзона 1(2) до экзона 4 вперёдобратно2) от экзона 4 до экзона 8 вперёдобратно3) от экзона 2 до экзона 4 вперёдобратно4) от экзона 3 до экзона 5 вперёдобратно5) от экзона 2 до экзона 5 вперёдобратноСпецифичность5’-cgggactgcggtaccaaatat-3’ экзон 15’-ctggcgcttgtgtttcaacat-3’ мРНК ЭРα 1170-1150,экзон 4 399-3795’-ggagctggttcacatgatca-3’ мРНК ЭРα 1416-1435экзон 4 at 645-6645’-taaaatgcagcagggattatct-3’ мРНК ЭРα 2195-2174,экзон 8 638-6175’-gaaagattggccagtaccaat-3’ мРНК ЭРα 847-867экзон 2 130-1505’-ctggcgcttgtgtttcaacat-3’ упомянут выше5’-caccaaccagtgcaccattga-3’ мРНК ЭРα 1029-1049экзон 3 167-1875’-agcaagttaggagcaaacagta-3’ мРНК ЭРα 1586-1565,экзон 5 426-4055’-gcagagaaagattggccagta-3’ мРНК ЭРα 842-862экзон 2 125-1455’-agcaagttaggagcaaacagta-3’ упомянут вышеБанк геновGI:28460664GI:4503602GI:5821720GI:4503602GI:5821720GI:4503602GI:5821724GI:4503602GI:5821718GI:4503602GI:5821719GI:4503602GI:5821721GI:4503602GI:5821718711)экзон 1экзон 2экзон 3экзон 4экзон 5экзон 6экзон 7экзон 853 065-53195 56124 96-286 355 142-258 403 350-685 1237 297-435 801 177-310 601 288-471 908 357->591 8432)экзон 1экзон 2экзон 3экзон 4экзон 5экзон 6экзон 7экзон 853 065-53195 56124 96-286 355 142-258 403 350-685 1237 297-435 801 177-310 601 288-471 908 357->591 8433)экзон 1экзон 2экзон 3экзон 4экзон 5экзон 6экзон 7экзон 853 065-53195 56124 96-286 355 142-258 403 350-685 1237 297-435 801 177-310 601 288-471 908 357->591 8434)экзон 1экзон 2экзон 3экзон 4экзон 5экзон 6экзон 7экзон 853 065-53195 56124 96-286 355 142-258 403 350-685 1237 297-435 801 177-310 601 288-471 908 357->591 8435)экзон 1экзон 2экзон 3экзон 4экзон 5экзон 6экзон 7экзон 853 065-53195 56124 96-286 355 142-258 403 350-685 1237 297-435 801 177-310 601 288-471 908 357->591 843Стрелки указывают приблизительное положениепраймеров в ЦПР, длина каждого экзона указанапод квадратами в правом углу, чёрными цифрамиуказанапродолжительностьэкзоннойпоследовательности72Таблица 4Пары праймеров для количественной ЦПРФрагментНаправление Последовательность1) связывающий экзоны 6 и 7 вперёд TCTATTATTTTGCTTAATTCTGGAGTобратно GGATATGGTCCTTCTCTTCCAGAGA2) связывающий экзоны 6 и 8 вперёд GATGAATCTGCAGGGAGAGGAGTобратноGCTCCATGCCTTTGTTACAGAATTA3) связывающий экзоны 7 и 8 вперёд CCTCCTCATCCTCTCCCACATобратноGGCACCACGTTCTTGCACT4) связывающий экзоны 2 и 3 вперёд GCTTCAGGCTACCATTATGGAGTCTобратноCGTTATGTCCTTGAATACTTCTCTTGAСпецифичностьБанк геновмРНК ЭРα 1708-1733экзон 6 289-311мРНК ЭРα 1786-1762экзон 7 344-320мРНК ЭРα 1671-1693экзон 6 252-274мРНК ЭРα 1930-1913изоформа э7 ЭРмРНК ЭРα 1881-1901экзон 7 439-459мРНК ЭРα 1964-1946экзон 8 407-389мРНК ЭРα 934-958экзон 2 217-241мРНК ЭРα 1012-986GI:4503602GI:5821722GI:4503602GI:5821723GI:4503602GI:5821722GI:4503602GI:244433GI:4503602GI:5821723GI:4503602GI:5821724GI:4503602GI:5821718GI:45036025) связывающий экзоны 1(2) и 3 вперёд CAGCACTTCTTGAAAAAGGATGTAGA экзон 1обратно ACACATATAGTCGTTATGTCCTCAGTGAT мРНК ЭРα 1023-1002экзон 3 161-140GI:28460664GI:4503602GI:5821719Количественная оценка результатов ЦПРЭффективность праймеров оценивалась по кривым разведения кДНК сиспользованием линейной регрессии (Hope et al., 2003; Ramakers et al., 2003).Величина изменений экспрессии транскриптов классической мРНК ЭР и еёсплайсинговых вариантов э7 и э2 у пациентов с БоАл и контрольныхслучаев подсчитывалась по методу Пфаффля (Pfaffl, 2001).

Относительныеуровни транскрипции определялись, исходя из первичных данных, поформуле:(эффективностьэкспрессиитранскриптовгенаЭР)–(порядокцикла)/(эффективность экспрессии референтных генов)–(порядок цикла) (Hope et al.,2003). В отдельных экспериментах подсчитывалось соотношение уровняэкспрессии изоформы э7 к уровню экспрессии ампликонов классическоймРНК ЭР, связывающих экзоны 6 и 7 и экзоны 7 и 8, а такжепропорциональноесоотношениеизоформыэ2ктранскриптам,связывающим второй и третий экзоны.Различия в уровнях транскрипции между пациентами с БоАл иконтрольными случаями оценивались с помощью теста Манн-Уитни.

Дляопределения корреляции изучаемых параметров с возрастом использовалсянепараметрический тест Спирмана. Все указанные эксперименты проведеныдважды с одинаковыми выводами. Нуклеотидная последовательность всехпродуктов ЦПР определялась дважды.Гибридизация in situ мРНК вазопрессина (ISH)Срезы, содержащие супраоптические и паравентрикулярные ядра,были депарафинированы и регидратированы, промыты в фосфатном буфере(PBS) (pH 7.6), обработаны 0.2 N HCl в течение 20 минут и затеминкубированы в водяной бане с 10 мкг/мл протеиназы K (PK) в буфере PK(10 ммоль/л соли Трис, 2 мM CaCl2) при температуре 370C в течение 15минут.

Затем срезы споласкивались в глициновом буфере (2мг/мл PBS),дважды в PBS и в 0.1% растворе Тритона X-100 в PBS для удаления липидов.2 пмоль вазопрессиновой пробы, состоявшей из 48 нуклеотидов,комплементарныхоснованиям411-458предшественника74препровазопрессина (Lucassen et al., 1997; Liu et al., 2000), были помечены вположении3’2мкл[-35S]dATPприпомощитерминальнойдеоксинуклеотидил трансферазы и очищены преципитацией этанолом.Меченая проба была разведена в гибридизационном буфере (HB),состоявшем из 50% де-ионизированного формамида, 0.5 моль/л NaCl, 10ммоль/л Tris-HCl (pH 7.5), 1ммоль/л EDTA, 1xDenhardt’s, 500 мкг/млдрожжевой tРНК, 10% декстран сульфата и 200 ммоль/л DTT. На каждыйсрез было добавлено 70мкл восстановленной пробы в гибридизационномбуфере, содержащей 1 миллион радиоактивных единиц.

Гибридизацияосуществлялась при температуре 420C в течение ночи. На следующий деньсрезы промывались один раз в 1x SSC в течение 30 минут при 50 0C, два разапо 15 минут в 0.1x SSC при 500C и два раза по 15 минут в 0.1x SSC прикомнатной температуре, дегидратировались в смеси 300 ммоль/л ацетатааммония и 100% спирта, смешанных в пропорциях 1:1, 3:7, 1:9 и 0:1 по 1минуте в каждом растворе, после чего были высушены под струёй холодноговоздуха.