Диссертация (Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования), страница 7

Экспрессия CXCR4 при раке предстательной железыусиливает инвазивную метастатическую способность опухолевых клеток вприсутствии лиганда CXCL12, тогда как ингибирование CXCR4 снижаетметастатическую способность [44]. Кроме того, CXCR4 опосредует адгезиюопухолевых клеток простаты через интегрины α5 и β3 [51]. Высокие уровниэкспрессии CXCR4 при раке предстательной железы человека связаны с болеечастым локальным рецидивом и отдаленными метастазами, что позволяетпредположить, что CXCR4 служит не только потенциальной терапевтическоймишенью, но и прогностическим маркером [84;190].Высокие уровни CXCR4 также наблюдаются в CD44 + / CD133 + CSCs(prostate cancer stem cells; стволовые клетки рака предстательной железы) [49].Поскольку CSCsмогут инициировать метастазированиеи способствуютформированию новых или рецидивирующих опухолей после первого курсалечения[56],путьCXCR4-CXCL12можеткосвеннометастазированию, поддерживая и стимулируя CSCs [91].способствоватьИсследованияпоказывают, что повышенная экспрессия CXCR4 и CXCL12 способствует адгезииCSC CD133 + / CD44 + простаты к внеклеточному белку фибронектину, которыйявляется важным для метастазирования в органы и возникновения вторичныхопухолей [49].

CXCL12 вызывает активацию пути PI3K и способствует34пролиферации CXCR4 + CSC простаты [49]. Таким образом, активный путьCXCR4-CXCL12вCSCsпростатыможеткосвенноспособствоватьметастазированию, регулируя клеточную адгезию, пролиферацию и потенциалдифференцировки [49].Также ось CXCL12-CXCR4 используется клетками ОМЛ, посредством чегоактивируются множественные сигнальные пути, включая (PI3K) / AKT и (MAPK)/ (ERK).

Mohle и соавт. [136] впервые сообщили о вариабельной экспрессииCXCR4 на поверхности клеток ОМЛ, указывая на положительную корреляциюмеждуповерхностнойэкспрессиейCXCR4иCXCL12-индуцированноймиграцией.35Рис.1 Роль TLRs в онкологическом процессеРис.2 Влияние хемокинов на развитие онкологического процесса36Суммируя, можно отметить, что исследования показывают, что CXCR4играет важную роль в метастазировании многих видов рака, включая ракмолочной железы [110-111;211-212], рак легких [160:189;212], колоректальныйрак[93;185;211],ракжелудка[219;220;225],ракяичников[82:88],ракпредстательной железы [8], поджелудочная железа [126;129 ], меланому [54;173],ракпищевода[87;98],ракмочевогопузыря[50],остеосаркому[149],нейробластому [117], глиобластому [169] и острый лимфобластный лейкоз [172].(рис.2)Активация TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитетаможет приводить к как прогрессии опухолевого процесса, так и к его регрессу.Влияние TLRs на судьбу опухолевых клеток зависит от множества факторов и ихсовокупности, которые были затронуты в обзоре.

В отличие от влияния TLRs насолидные опухоли, влияние данных рецепторов на развитие патологическихсостояний в гемопоэзе остаются практически неизученными.Активация TLRs ведет к выработке цитокинов, в том числе и хемокинов,которые также участвуют в развитии онкологического процесса и имеют двоякуюроль в процессе опухолеобразования. В связи с вышесказанным необходим болеемногоуровневый подход к изучению влияния факторов врожденного иммунитетав развитии онкологических процессов. (рис1; 2)37ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1.

Характеристика клеточных линий и клинических группРабота была проведена при сотрудничестве с лабораторией молекулярнойиммунологии (заведующая лабораторией чл.-корр. РАН, д.м.н. Свитич О.А.)ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, экспериментальной иммунологии (к.м.н.,заведующая лабораторией Аммур Ю.И.) ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова иотделением клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им.М. Ф. Владимирского (заведущая отделением Клинушкина Е.Ф.) Лабораториейэкспериментальнойиммунологиибылипредоставленыматериалыдляисследования - клеточные линии К562 и Reh.

Клеточная линия К562представляет из себя эритроидно-миелоидные предшественники, выделенные изплевральной жидкости женщины 53 лет с хроническим миелоидным лейкозом.Клеточная линия Reh представляет из себя клетки, выделенные от пациента спре-В острым лимфобластным лейкозом.Клинический материал в виде крови от пациентов с острым миелоиднымлейкозом (М4) до и после химиотерапии был предоставлен отделениемклинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им.

М. Ф.Владимирского, клинический материал от пациентов группы контроля былпредоставлен ФГБНУ НИИВС им. И.И.Мечникова.Общее количество пациентов составило 35 человек. Пациенты былиподразделены на три группы:1.ПациентысвпервыевыявленнымОМЛ(М4)доназначенияпослепервогохимиотерапии в количестве десяти человек. (таб.1)2.ПациентысвпервыевыявленнымОМЛкурсахимиотерапии, через три недели от окончания, в количестве шести человек.3.Контрольная группа пациентов, соответствующая критериям включения,невключения пациентов в исследование и исключения пациентов группыконтроля из исследования в количестве пятнадцати человек. (таб.2)38Таблица 1.Критерии включения, невключения и критерии исключения пациентов сострым миелоидным лейкозом в клиническую группу исследованияКлиническая группа пациентов с острым миелоидным лейкозом (М4)(n=10)Критерии включенияКритерии невключения1.

Наличие письменногоинформированного согласияпациента на участие висследовании;2.Мужчины и женщины в возрасте18 – 50 лет3. Установленный диагноз острыймиелоидный лейкоз (М4) дохимиотерапии и послехимиотерапии1.Возраст младше 18 и старше 50 лет2.Беременность, кормление грудью –3.Наличие сопутствующейпатологии: острые инфекционныезаболевания, ВИЧ-инфицирование,гепатит В, гепатит С, хроническиеинфекционные заболевания в фазеобострения, аутоиммунныезаболевания.Критерииисключения1.Отказ пациентаот дальнейшегоучастия висследовании;2.БеременностьТаблица 2.Критерии включения, невключения и критерии исключения в группуздоровых доноровКонтрольная группа (n=25)Критерии включения1.Наличие письменногоинформированного согласияпациента на участие висследовании2.Мужчины и женщины ввозрасте 18 – 50 лет3.Практически здоровыепациентыКритерии невключения1.Возраст до 18 лет и после 50 лет2.Беременность, кормление грудью2.Острые инфекционныезаболевания,3.ВИЧ-инфицирование,4.Гепатит В, гепатит С,5.Хронические инфекционныезаболевания в фазе обострения,6.Аутоиммунные заболевания,7.Аллергические заболевания,8.Эндокринологические заболевания9.Онкологические заболевания ванамнезе и на момент проведенияисследования10.Грубые генетические аномалииКритерииисключения1.Отказ пациентаот дальнейшегоучастия висследовании;2.Беременность392.2 МатериалыВ качестве хемоаттрактанта использовался СXCL12 (ThermoFisher,США).

Вкачестве TLRs лиганда использовался DNA_lig, синтезированный ЛабжиновымП.А. на базе лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И.Мечникова.2.3 Методы2.3.1 Ведение клеточных культурКлеточные культуры К562 и Reh культивировали суспензионным методом в средеRPMI с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки 10% и растворагентамицина 1% в культуральных флаконах. Клетки инкубировали при 37оС ватмосфере СО2. При достижении оптимальной плотности 1.0х105 - 1.0х106клеток/мл проводили пересев культуры и дальнейшее культивирование.

Подсчетклеток проводили с помощью камеры Горяева.2.3.2 Выделение МНК от пациентовСотрудниками отделения клинической гематологии и иммунотерапии проводилсяотбор крови пациентов в вакуумные гепаринизированные пробирки в количестве10 мл, затем в течение часа кровь доставлялась в лабораторию, после чегопроводилось выделение мононуклеарных клеток. Проводилось разбавление кровисредойRPMI-1640,безглутамина(ПанЭко,РФ)всоотношении1:3соответственно. Разбавленная кровь наслаивалась на фиколл (ПанЭко, РФ) всоотношении 1:3, после чего пробирки центрифугировали при 1000 rpm в течение40 минут. После окончания центрифугирования производился сбор интерфазы,содержащей МНК в отдельную пробирку.

МНК разводились средой RPMI всоотношении 1:1, после чего центрифугировались при 1200 rpm в течение 15минут. После центрифугирования удалялась надосадочная жидкость, МНКразводились средой RPMI-1640 в соотношении 1:1 и проводилось повторноецентрифугирование при 1200 rpmв течение 15 минут. Полученный осадок40ресуспендировали в 1 мл среды RPMI-1640, после чего проводился подсчетколичества клеток в камере Горяева.2.3.3 Определение жизнеспособности клетокДля определения жизнеспособности клеток использовали 0,2% раствортрипановогосинего(Serva,США).Окрашиваниеклетоккрасителемосуществляли согласно стандартному протоколу. Подсчет клеток проводили спомощью камеры Горяева.2.2.4 Исследование хемотаксиса клетокДля исследования хемотаксиса использовалась камера Бойдена фирмыMultiScreen Migration Invasion and Chemotaxis Filter Plate (MERCK, Германия) сразмерами пор 5 и 8 мкм. Камера Бойдена состоит из трех основных элементов:верхний отсек, куда помещаются клетки, нижний отсек, куда мигрируют клетки ипоры между ними.

MultiScreen Migration Invasion and Chemotaxis Filterпредставляет из себя 96-ти луночный планшет, каждая лунка из которых являетсяодноразовой камерой для миграции. В верхний отсек каждой лунки помещалось60 мкл взвеси клеток в концентрации 1.0х106 клеток/мл. В нижний отсек первойкамеры помещалось 150 мкл раствора CXCL12 в концентрации 200 нг/мл, второйкамеры 150 мкл раствор DNA_lig в концентрации 100 мкг/мл и третьей камеры150 мкл среды RPMI-1640 в качестве контроля.