Диссертация (Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования)

Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего образования Первый Московский государственныймедицинский университет имени И.М. Сеченова Министерстваздравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет)На правах рукописиФилина Александра БорисовнаРОЛЬ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ВПРОЦЕССЕ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИЯ14.03.09 Клиническая иммунология, аллергологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:академикРАН,профессор, д.б.н.ЗверевВиталийВасильевиччлен – корр. РАН, д.м.н,директор ФГБНУ НИИВСим.И.И.МечниковаСвитичОксанаАнатольевнаМосква - 2019ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ………………………………………………………….4ГЛАВА 1. ОБЗОРЛИТЕРАТУРЫ.РОЛЬХРОНИЧЕСКОГОВОСПАЛЕНИЯ И TLRS В ОНКОЛОГИИ………………………..1.1.НегативнаярольTLRsвонкогенезе…………………………………………………………...1.2TLRs – противоопухолевое действие……………………………...12161.3Роль TLRs в остром миелоидном лейкозе ………………………..191.41.51.6Роль хемокинов в развитии онкологического процесса.…………Хемокины в ангиогенезе…………………………………………...Хемокины в метастазировании…………………………………….222526ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………382.1.Характеристика клеточных линий и клинических групп………..382.2.Материалы ………………………….……………….………….......402.3Методы………………………………………………………………402.3.12.3.2Ведение клеточных культур ………………………….……………Выделение МНК от пациентов ……….………….………………..40402.3.32.3.42.2.5.2.3.62.3.72.3.8Определение жизнеспособности клеток ………………………….Исследование хемотаксиса клеток ………..………………………Выделение РНК ……………………..………………………….......Реакция обратной транскрипции…………………………………..Проведение ПЦР-РВ ……………….………...…………………….Статистический анализ данных …………………………………...414141424245ГЛАВА 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ………………………………10463.1Хемотаксис клеток опухолевых линий Reh и К562 к DNA_lig….463.2Хемотаксис клеток опухолевых линий Reh и К562 к СXCL12….503.3Экспрессия гена CXCL12 в клетках К562……………………543.4Хемотаксис мононуклеарных клеток, выделенных от здоровыхдоноров и от пациентов с острым миелоидным лейкозом до ипосле химиотерапии………………………………………………...Экспрессия генов CXCL12, CCR4, EGFR, TLR9 в3.5562мононуклеарных клетках, выделенных от здоровых доноров ипациентов с острым миелоидным лейкозом до и послехимиотерапии……………………………………………………….64ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………..77ВЫВОДЫ………………………………………….………………...80СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ …………………..................................81СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………......................823ВВЕДЕНИЕОткрытие таких факторов врожденного иммунитета как хемокины, а такжеToll-подобные рецепторы (Toll-like receptos - TLRs) стало важнейшей вехой вистории иммунологии и смежных специальностей [4].

С середины XX векапостепенно нарастало количество исследований, посвященных вышеописаннымфакторам. Хемотаксис, основными участниками которого являются хемокины иих рецепторы, представляет из себя физиологический процесс, участвующий внаправленном движении клеток. TLRs, которые относятся к так называемымраспознающим рецепторам врожденного иммунитета (PPRs, pattern recognitionreceptors), также играют важнейшую роль в реакциях врожденного иммунитета иэкспрессируются практически всеми клетками человеческого организма, вбольшей степени иммунными клетками.консервативныепоследовательностиTLRsPAMPsраспознает определенные(pathogen-associatedmolecularpattern) и DAMPS (damage-associated molecular patterns) и является первой линиейзащиты в ответ на проникновение чужеродные патогенов [6].Несмотря на большое количество научных исследований, посвященныхроли данных структур в развитии иммунного ответа, только последние двадесятилетия стали появляться данные о влиянии TLRs и хемокинов на развитиетаких заболеваний, как аутоиммунные, онкологические и др.Исследования последних лет выявили, что влияние TLRs может быть какопухоль – активирующим, так и опухоль – ингибирующим.

Активация TLR4 иTLR2 приводит к активному прогрессированию опухоли, в то время какактивация TLR3,5,7,9 в большинстве случаев - к снижению прогрессированияопухоли, однако есть данные, что в определенных видах опухолей активацияданных рецепторов ведет к прогрессии. Таким образом, роль TLRs вопухолеобразовании до конца не исследована и требует более тщательногоизучения.Также при активации TLRs запускается ряд сигнальных путей, приводящихк продукции хемокинов, участвующих в хемотаксисе клеток, в том числе и4опухолевых. На сегодняшний день, по данным литературы известно, чтохемотаксис активно участвует в иммунной инвазии, ангиогенезе и диссеминацииопухолевых клеток. В иммунной инвазии работают такие хемокины, как CCL2 ,CCL5, CL2, CCL4, CCL17, CCL22 и CXCL12; в ангиогенезе - CXCL1, CXCL2,CXCL8 ; в метастазировании –CXCL12, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL8.Однако до конца не понятны отрицательные и положительные функциихемотаксиса и его компонентов в опухолеобразовании.Несмотря на большой интерес к данной проблеме, существует достаточнобольшоеколичествоисследований,направленныхлишьнаодинизвышеперечисленных факторов, в то время как взаимовлияние их друг на друга небыли изучены.

Также в проведенных работах не учитывается возможностьауктоактивацииопухолевыхклетокзасчетвыработкихемокиновилиповышенной экспрессии TLRs самими клетками.Таким образом, для понимания миграции опухолевых клеток недостаточноисследований по влиянию одного фактора врожденного иммунитета нахемотаксис опухолевых клеток, в связи с чем необходимо изучить возможностьTLR-опосредованного хемотаксиса, СXCL12 – опосредованный хемотаксис,CXCL12 – опосредованную экспрессию TLRs и гетерологичных хемокиновыхрецепторов, что может менять ответ на один и тот же хемокин в различныхусловиях.Целью настоящего исследования явилось изучение влияния CXCL12 илиганда TLR9 на хемотаксис опухолевых клеток, а также на экспрессию геновСXCL12, CCR4, EGFR и TLR9.Задачи исследования1.Исследовать спонтанный и индуцированный хемотаксис клеток опухолевыхлиний (К562, Reh).2.Изучить спонтанный и индуцированный хемотаксис МНК здоровыхдоноров.53.Исследовать хемотаксис МНК, выделенных от пациентов с острыммиелоидным лейкозом (М4) до химиотерапии и после химиотерапии, через тринедели после окончания первого курса, по направлению к CXCL12 и DNA_lig.4.Изучить экспрессию генов CXCL12, CCR4, EGFR и TLR9 в интактных имигрировавших клетках.Положения, выносимые на защиту1.Создана модель, которая позволяет оценить спонтанный и индуцированныйхемотаксис опухолевых клеток.

Получены данные об ингибирующем действиилиганда TLR9 и стимулирующем действии CXCL12 на хемотаксис опухолевыхклеток линий К562 и Reh.2.Определена разнонаправленная динамика спонтанного и индуцированногохемотаксиса мононуклеарных клеток, выделенных от здоровых доноров и отпациентов с острым миелобластным лейкозом до и после проводимой терапии.3.Выявленныйэкспрессионныйпрофильхемокиновирецепторовврожденногоиммунитета показал значительное ингибирующее действиеСXCL12экспрессиюнагенаEGFRвклеткахОМЛ.Крометого,продемонстрированы сниженный уровень хемотаксиса МНК пациентов с ОМЛдо химиотерапии по направлению к CXCL12 в связи с высокой экспрессиейCXCL12, а также перекрестная активация экспрессии гена рецептора CCR4 упациентов с ОМЛ до и после химиотерапии.Научная новизнаВпервые показано, что миграция к хемокину CXCL12 зависит от уровняэкспрессии CXCL12 в опухолевой клетке.Выявлено, что влияние химиотерапии снижает уровень экспрессии CXCL12опухолевыми клетками.Впервые показано, что воздействие CXCL12 способствует экспрессиигетерологичного рецептора CCR4.6Впервые определено, что влияние CXCL12 на мононуклеарные клетки,выделенные от пациентов с острым миелоидным лейкозом снижают экспрессиюEGFR.Впервые исследована миграция клеток клеточных линий K562, Reh,мононуклеарных клеток, выделенных от здоровых доноров, пациентов с ОМЛ дои после химиотерапии по направлению к DNA_lig.Теоретическая и практическая значимостьРазработаны системы на основе ПЦР в режиме реального времени дляколичественного определения экспрессии генов ССR4, CXCL12.Отработана схема исследования хемотаксиса опухолевых клеточных линийК562, Reh, мононуклеарных клеток, выделенных от здоровых доноров ипациентов с острым миелоидным лейкозом с использованием камеры Бойдена.

Атакже подобраны оптимальные концентрации CXCL12 и DNA_lig для изученияхемотаксиса клеточных линий, мононуклеарных клеток, выделенных от здоровыхдоноров и пациентов с острым миелоидным лейкозом.Представленная модель может быть использована для оценки хемотаксисаразличных опухолевых клеток, полученные данные могут быть использованы дляпрогнозорования течения опухолевого процесса.Апробация результатовАпробация диссертации состоялась 30 апреля 2019 года на совместнойнаучной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологииФГАОУ ВО Первый МГМУ им.

И.М.Сеченова Минздрава России (СеченовскийУниверситет) и лаборатории молекулярной иммунологии ФГБНУ НИИВСим.И.И.Мечникова.Внедрение результатов работы в практикуПолученныеданныевнедренывкурсобученияпонаправлению«Иммунология» на кафедре Микробиологии, вирусологии и иммунологии7Сеченовского Университета и на кафедре иммунологии МБФ РНИМУ им.Н.И.Пирогова.Личное участие автора в получении результатовНаучные результаты, обобщенные в диссертационной работе Филиной А.Б.,получены ею самостоятельно на базе кафедры микробиологии, вирусологии ииммунологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и лаборатории молекулярнойиммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И.

Мечникова в сотрудничестве сотделением клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им.М. Ф. Владимирского. Автором лично в полном объеме были выполнены всеэтапы диссертационного исследования: планирование, организация, подборпациентов,лабораторнаякультивированиеработаопухолевых(выделениеклеток,мононуклеарныхисследованиехемотакиса,клеток,изучениеэкспрессии факторов врожденного иммунитета), статистическая обработкаданных.Авторвыражаетискреннююпризнательностьиблагодарностьруководителю клиники клинической гематологии и иммунотерапии профессору,доктору медицинских наук Голенкову Анатолию Константиновичу и заведующейотделением клинической гематологии и иммунотерапии Клинушкиной ЕленеФедоровне ГБУЗ МО МОНИКИ им.

М. Ф. Владимирского за ценные советы иконсультирование в области онкогематологии.Соответствие паспорту научной специальностиНаучные положения диссертации соответствуют шифрам и формулеспециальности: 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология. Результатысоответствуют по следующими областями исследований этой специальности:фундаментальныеисследования,посвященныеизучениюстроения,функционирования иммунной системы.8Публикации результатов исследованияПо материалам диссертации опубликовано 4 работы в рецензируемыхнаучных журналах, рекомендованных ВАК РФ, из них одна - в журналеиндексируемом в базе Scopus.Объем и структура диссертацииДиссератция изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована4 таблицами и 20 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описанияматериалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения,выводов, списка сокращения, списка литературы.Библиографический указатель включает 227 отечетсвенных и заруюежныхисточников.9ГЛАВА 1.