Диссертация (1140954), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Подсчет мигрировавших клеток внижний отсек проводился через 15 минут, 60 минут и 24 часа. Для каждойвременной точки использовалась отдельная камера. Подсчет мигрировавшихклеток проводили с помощью камеры Горяева.2.3.5 Выделение РНКДлявыделенияРНКизклетокметодомсорбциинасиликагелеиспользовали набор “Рибо-сорб” (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс,Россия).
Выделение РНК проводили согласно инструкции производителя.Выделенные образцы РНК хранили при температуре минус 70Со.412.3.6 Реакция обратной транскрипцииДля получения кДНК исследуемых генов на матрице выделенной РНК былапроведена реакция обратной транскрипции. Подбор праймеров для реакцииобратнойтранскрипциипроводилсясогласнонуклеотиднымпоследовательностям мРНК исследуемых генов (получены в базе данных GeneBank) с помощью программы Vector NTI 8. Праймеры, используемые в работе,были синтезированы на фирме Синтол (Россия).2.3.7 Проведение ПЦР-РВНа первом этапе реакции обратной транскрипции проводили отжигпраймеров на РНК, для этого готовили смесь следующего состава:1 мкл Random праймеров (1 ое/мл);3 мкл обратных праймеров (1 ое/мл);2 мкл мРНК.В отрицательный контроль вместо мРНК добавляли 2 мкл Н2О (Синтол,Россия).Полученную смесь инкубировали в термостате при 75 оС в течение 3 минут.После отжига праймеров пробирки постепенно охлаждали, для этого ихпомещали в штатив со льдом.
На следующем этапе в пробы добавлялиреакционную смесь следующего состава:3 мкл – SE-буфер Обратная транскриптаза M-MulV (Сибэнзим, Россия);2 мкл – 25 мМ дНТФ (Сибэнзим, Россия);19 мкл – Н2О (Синтол, Россия);0,05 мкл – M-MulV Обратная транскриптаза (Сибэнзим, Россия).42Пробирки помещали в амплификатор “Терцик” (ДНК-технологии, Россия) иинкубировали в следующем режиме: 37 оС – 60 мин; 95оС – 10 мин. Полученныеобразцы хранили при температуре минус 70оС.В настоящей работе был использован метод ПЦР в режиме реальноговремени(ПЦР-РВ).Приготовлениеиспользованием компонентовреакционнойсмесипроводилис“Набора реактивов для проведения ПЦР-РВ вприсутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)” (Синтол,Россия).
Реакционную смесь готовили согласно инструкции производителя.Оптимальные концентрации праймеров, зондов и MgCl2 в реакционной смесиподбирались дополнительно для каждой системы.Нуклеотидные последовательности праймеров были сконструированы спомощью программы Vector NTI 8 согласно последовательностям мРНКисследуемых генов, которые были получены в базе данных GenBank.
Праймеры,используемые в настоящей работе, были синтезированы на фирме Синтол(Россия).Для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBRGreen I готовили реакционную смесь следующего состава:1,5 мкл – 10х ПЦР буфер Б (Синтол, Россия);1,5 мкл – 25 мМ MgCl2 (Синтол, Россия);1,5 мкл – 2,5 мМ дНТФ (Синтол, Россия);1 мкл – прямой праймер (таб.3)1 мкл – обратный праймер (таб.3)5,5 мкл – H2O (Синтол, Россия);0,2 мкл – Taq ДНК-полимераза, 5 Е/мкл (Синтол, Россия);3 мкл – образец кДНК, полученной в ходе реакции обратной транскрипции.43В отрицательный контроль реакций вместо кДНК добавляли 3 мкл H2O(Синтол, Россия).
Общий объем реакционной смеси составлял 15 мкл.Составление реакционных смесей проводили в стерильных условиях.Послеприготовленияреакционнойсмесипробиркипомещаливамплификатор ДТ-96 (Компания «ДНК-технология», Россия) и проводили ПЦРРВ по заданной программе:1. 950С – 2 минуты;2. 950С 20 секунд.40 циклов58 – 64 С – 40 секунд03. 900С 15 секунд100 цикловСпецифичность фрагментов, амплифицированных в ходе ПЦР-РВ вприсутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I, оценивали с помощьюреакции плавления ДНК.Таблица 3Последовательности используемых праймеров в работеНазвание праймераПоследовательность праймераСXCL12_senaga-gcc-aac-gtc-aag-cat-ctСXCL12_an_senagg-gtc-taa-atg-ctggcaaaEGFR_sengag-tcg-ggc-tct-gga-gga-aaEGFR_an_sengac-tgc-taa-ggc-ata-gga-attCCR4_senatt-gcc-tca-cag-acc-ttc-ctc-aCCR4_an_sencca-aat-gcc-ttg-atg-cct-tct-tTLR9_ sentgg-tgt-tga-agg-aca-gtt-ctc-tcTLR9_ an_sencac-tcg-gag-gtt-tcc-cag-c442.3.8 Статистический анализ данныхДля статистической обработки полученных результатов рассчитывалисреднее значение и стандартное отклонение от среднего.
В работе результатыпредставлены в виде «медиана (х0,75 – х0,25)». Статистический анализ полученныхданных производился с помощью непараметрического критерия Манна-Уитнидля сравнения двух выборок. Для рассчета корреляционной зависимостииспользовался непараметрический метод ранговой корреляции Спирмена.Статистическийанализпроводилисиспользованиемкомпьютернойстатистической программой BioStat, а также программы Excel.45ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕНа первом этапе научно-экспериментальной работы необходимо былоподобрать оптимальные условия для исследования хемотаксиса in vitro,удовлетворяющие поставленные нами задачи. В качестве исследуемого объектабыли подобраны две клеточные линии, которые относятся к разным типамлейкоза: К562 и Reh.
Для подбора размера микропор были взяты камеры Бойденафирмы MultiScreen Migration Invasion and Chemotaxis Filter Plate (MERCK,Германия) с размерами пор 5 и 8 мкм. Хемотаксис каждой линии исследовался сиспользованием двух видов камер.3.1 Хемотаксис клеток опухолевых линий Reh и К562 к DNA_ligДинамика хемотаксиса клеток по направлению к DNA_lig увеличивается втечение первых десяти минут, затем в течение суток снижается. Динамикамиграции клеток в контроле постепенно увеличивается на протяжении всегоэксперимента в течение суток.
Хемотаксис клеточной линии Reh по направлениюк DNA_lig достоверно ниже через 24 часа в 4 раза. Достоверных отличий междухемотаксисом по направлению к лиганду и миграцией в контроле через 10 и 60минут нет. (рис.3)Хемотаксис клеток по направлению к DNA_lig увеличивается в течениепервых десяти минут, затем в течение следующего часа постепенно снижается, втечение следующих суток динамика миграции возрастает. Миграция клеток вконтроле увеличивается в течение первых десяти минут, затем в течение сутокпостепенно снижается.
Хемотаксис клеточной линии Reh по направлению кDNA_lig достоверно ниже относительно контроля через 10 и 60 минут в 1,3 и 3раза соответственно. Достоверных отличий между хемотаксисом по направлениюк лиганду и миграцией в контроле через сутки нет.Динамика хемотаксиса клеток линии К562 по направлению к DNA_ligпостепенно нарастает в течение суток. Динамика миграции клеток в контроленарастает первый час исследования, затем резко снижается через сутки.46Количество мигрировавших клеток по направлению к DNA_lig достоверно нижеотносительно контроля через 10 минут в 5 раза и достоверно ниже через 60 минутв 3.7 раза. Достоверных отличий между хемотаксисом по направлению к лигандуи миграцией в контроле через 24 часа нет.Хемотаксис клеток линии К562 по направлению к DNA_lig постепеннонарастает в течение суток.
Динамика миграции клеток резко нарастает за первые10 минут, затем в течение часа находится в состоянии плато, после чего в течение24 часов незначительно снижается. Количество мигрировавших клеток понаправлению к DNA_lig достоверно ниже относительно контроля через 10 минутв 2,1 раза и достоверно ниже через 60 минут в 1,4 раза. Достоверных отличиймежду хемотаксисом по направлению к лиганду и миграцией в контроле через 24часа нет. (рис.4)47абРис.3 Динамика DNA_lig - индуцированного хемотаксиса и cпонтанноймиграции клеточной линии Reh в камере Бойдена, размер пор 8 мкм(а) и 5мкм (б)Поосиабсцисс–время,черезкотороепроводилиизмерениемигрировавших клеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).48абРис.4 Динамика DNA_lig - индуцированного хемотаксиса и cпонтанноймиграции клеточной линии К562 в камере Бойдена, размер пор 5 мкм(а) и8мкм (б)Поосиабсцисс–время,черезкотороепроводилиизмерениемигрировавших клеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).493.2 Хемотаксис клеток опухолевых линий Reh и К562 к СXCL12Динамика хемотаксиса по направлению к CXCL12 нарастает на протяжениивсего эксперимента, что соответствует динамике в контроле.Достоверныхотличий от контроля на 10 минуте и 60 минуте эксперимента нет.
Количествомигрировавших клеток по направлению к CXCL12 достоверно выше от контролячерез 24 часа в 1,2 раза.Хемотаксис по направлению к CXCL12 нарастает на протяжении всегоэксперимента. Динамика миграции в контролеувеличивается в течение часапостепенно, затем постепенно снижается в течение суток. Достоверных отличийот контроля на 10 минуте эксперимента нет. Количество мигрировавших клетокпо направлению к CXCL12 достоверно выше контроля через 60 минут и 24 часа в1.6 и 4.4.
раза. (рис.5)Динамика хемотаксиса по направлению к CXCL12 нарастает на протяжениичаса, в течение 24 часов падает. Динамика миграции в контроле увеличивается втечение часа постепенно, что соответствует динамике в контроле. Количествомигрировавших клеток достоверно отличается в 1.4 раза через 24 часа. Через 10минут и 24 часа миграции достоверных отличий нет.Динамика хемотаксиса по направлению к CXCL12 нарастает на протяжениивсего эксперимента, что соответствует динамике в контроле.Количествомигрировавших клеток по направлению к CXCL12 достоверно выше контролячерез 10, 60 минут и 24 часа в 2, 1.3 и 1.3 раз соответственно. (рис.6)50абРис.5 Динамика CXCL12 - индуцированного хемотаксиса и cпонтанноймиграции клеточной линии Reh в камере Бойдена, размер пор 5 мкм(а) иразмер пор 8 мкм(б)По оси абсцисс – время, через которое проводилимигрировавших клеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаизмерениеПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).51абРис.6 Динамика CXCL12 - индуцированного хемотаксиса и cпонтанноймиграции клеточной линии К562 в камере Бойдена, размер пор 8 мкм(а) и 5мкм(б)По оси абсцисс – время, через которое проводилимигрировавших клеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаизмерениеПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12 * - показатель достоверно отличается от такового винтактных клетках (р≤0,05)52На первом этапе нами был исследован индуцированный хемотаксис сиспользованием DNA_lig и CXCL12 и спонтанная миграция клеток опухолевыхлиний Reh и К562 с использованием камеры Бойдена с размерами пор 5 мкм и 8мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
