Диссертация (Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования), страница 10

Drury и др. былопродемострировано, что CXCL12 может иметь антиметастатический эффект, впроведенном ими исследованиями было показано что экзогенный CXCL12являетсямощнымингибиторомметастазированияприонкологическихзаболеваниях. Таким образом дальнейшей задачей второго этапа нашегоисследования стояло исследовать экспрессию факторов врожденного иммунитета,которые могут влиять на хемотаксис, а также могут способствовать прогрессииопухолевых клеток.3.5 Экспрессия генов CXCL12, CCR4, EGFR, TLR9 в мононуклеарныхклетках, выделенных от здоровых доноров и пациентов с острыммиелоидным лейкозом до и после химиотерапииВ настоящее время недостаточно данных о влиянии рецепторов нехемокинового ряда, а также взаимовлиянии гетерологичных рецепторов нахемотаксис опухолевых клеток. В связи с этим нами была изучена экспрессиярецепторов врожденного иммунитета под воздействием DNA_lig и CXCL12 вМНК, выделенных от здоровых доноров, а также от пациентов с ОМЛ до и послехимиотерапии.Экспрессия гена CXCL12 в мигрировавших МНК здоровых пациентов какв контроле так и под действием хемокина CXCL12 достоверно не отличаласьчерез 10 и 60 минут.

Динамика экспрессии гена CXCL12 в МНК через 24 часапод воздействием CXCL12 была достоверно ниже контроля в 10 раз. (рис.13)64Экспрессия гена CCR4 под действием CXCL12 достоверно выше контроля10 минут и ниже через 24 часа в 900 и 427 раз соответственно. Экспрессия CCR4в мигрировавших МНК здоровых пациентов под действием хемокина CXCL12достоверно не отличалась через 60 минут эксперимента. (рис.14) Экспресcия генаEGFR в МНК, выделенных от здоровых пациентов достоверно выше контролячерез 60 минут в 23 раза. Через 10 минут и 24 часа экспрессия EGFRстатистически не достоверна.

(рис.15) Экспресcия гена TLR9 в МНК, выделенныхот здоровых пациентов достоверно выше контроля через 24 часа в 7 раз. Через 10и 60 минут экспрессия гена TLR9 статистически не достоверна. (рис.16)Рис.13 Динамика экспрессии CXCL12 в МНК, выделенных от здоровыхдоноровПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).65Рис.14 Динамика экспрессии CCR4 в МНК, выделенных от здоровыхдоноровПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).66Рис.15 Динамика экспрессии EGFR в МНК, выделенных от здоровыхдоноровПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).67Рис.16 Динамика экспрессии TLR9 под действием CXCL12 в МНК здоровыхдоноровПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).68Экспрессия гена CXCL12 в мигрировавших МНК, выделенных отпациентов с ОМЛ до химиотерапии, под действием CXCL12 была достовернониже контроля через 10, 60 минут и 24 часа в 16, 3.9 и 24.4 раз соответственно.(рис.17) Была выявлена высокая отрицательная корреляционная зависимостьхемотаксиса МНК от пациентов с ОМЛ до химиотерапии с экспрессией генаCXCL12 через 60 минут и 24 часа (rs = 0,75).Показано,чтоэкспрессиягенаCXCL12вмигрировавшихМНК,выделенных от пациентов с ОМЛ после химиотерапии, под действием CXCL12была достоверно ниже контроля через 60 минут и 24 часа в 2.9 и 5.9 разсоответственно.

Достоверных отличий экспрессии CXCL12 под воздействиемCXCL12 от контроля через 10 минут не было. (рис.17)Экспрессия гена ССR4 в мигрировавших МНК, выделенных от пациентовс ОМЛ до начала химиотерапии, под действием CXCL12 была достоверно вышеконтроля через 10 минут в 39,3 раза и ниже через 24 раза в 5128 раз. Через 60минут данные между экспрессией гена CCR4 в клетках, мигрировавших понаправлению к CXCL12 и контролем недостоверны. Экспрессия гена ССR4 вмигрировавших МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ после химиотерапии, поддействием CXCL12 была достоверно ниже контроля через 10 минут в 4 раза ивыше через 24 раза в 2,1 раз.

Через 60 минут данные между экспрессией генаCCR4 в клетках, мигрировавших по направлению к CXCL12 и контролемнедостоверны. (рис.18)Установлено, что экспрессия гена EGFR в мигрировавших МНК,выделенных от пациентов с ОМЛ до начала химиотерапии, под действиемCXCL12 была достоверно ниже контроля через 10 минут в 8,3 раз. Через 60 минути 24 часа данные между экспрессией EGFR в клетках, мигрировавших понаправлению к CXCL12 и контролем недостоверны.Экспрессия гена EGFR в мигрировавших МНК, выделенных от пациентов сОМЛ после химиотерапии, под действием CXCL12 была достоверно вышеконтроля через 10 минут в 12,8 раза и ниже через 60 раза в 5 раз.

Через 24 часа69минут данные между экспрессией EGFR в клетках, мигрировавших понаправлению к CXCL12 и контролем недостоверны. (рис.19)На следующем этапе была определена экспрессия гена TLR9 вмигрировавших МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ до начала химиотерапии,под действием CXCL12 была достоверно ниже контроля через 10 минут в 576 рази в 187.5 раз выше контроля через 24 часа. Через 60 минут между экспрессиейTLR9 в клетках, мигрировавших по направлению к CXCL12 и контролемнедостоверны. Экспрессия гена TLR9 в мигрировавших МНК, выделенных отпациентов с ОМЛ после химиотерапии, под действием CXCL12 достоверно неотличается от контроля на протяжении всего эксперимента.

(рис.20)70абРис.17 Динамика экспрессии CXCL12 под действием CXCL12 в МНКпациентов до химиотерапии (а) и после (б)По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).71абРис.18 Динамика экспрессии ССR4 под действием CXCL12 в МНК пациентовдо химиотерапии (а) и после (б)По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).72Рис.19 Динамика экспрессии EGFR под действием CXCL12 в МНКпациентов до и после химиотерапииПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).73абРис.20 Динамика экспрессии TLR9 под действием CXCL12 в МНК пациентовдо химиотерапии (а) и после (б)По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).74Нами были получены данные о сниженной экспрессии CXCL12 в МНК отздоровых доноров, что объясняет высокую чувствительность клеток к данномухемокину и высокий уровень мигрировавших клеток к CXCL12, в то время какконституивная экспрессия гена CXCL12 в клетках ОМЛ до химиотерапии говорито возможном высоком уровне выработки данного хемокина самой опухолевойклеткой.

Введенный извне CXCL12 приводит к снижению экспрессии, а также котсутствия чувствительности клеток на хемокин CXCL12. После проведеннойхимиотерапии конститутивная экспрессия остается также высокой, однако,уровень экспрессии ниже чем в МНК до химиотерапии. Вышесказанноеуказывает на возможную причину низкого уровня хемотаксиса по направлению кCXCL12.Нами была исследована экспрессия CCR4 под воздействием CXCL12, таккак в китайском исследовании, проведенном Yan Zhang с соавт. было показано,что активация CCR4 способствует интернализации CXCR4, который являетсярецептором CXCL12, что может приводить к снижению хемотаксиса опухолевыхклеток, а также к неотвечаемости клетки на воздействия CXCL12.

Было показано,что экспрессия CCR4 в МНК здоровых доноров под действием CXCL12повышается на 10 минут, затем снижается, что соответствует результатамполученным для экспрессии в МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ дохимиотерапии. В МНК от пациентов с ОМЛ после химиотерпии уровень какконститутивной так и индуцированной экспрессии CCR4 значительно ниже, приэтом динамика экспрессии под действием CXCL12 положительная. Данные поэкспрессии CCR4 при активации хемокином CXCL12 указывают на взаимосвязьгетерологичных рецепторов и подтверждает теорию о возможных путях сниженияметастазирования опухолевых клеток не только путем ингибирования рецепторовCXCL12.Нами также был выбран рецептор EGFR, так как на настоящий моментингибиторы этого рецептора используются для лечения немелкоклеточного ракалегких и поджелудочной железы и есть сообщения и попытках использованияданных препаратов при ОМЛ, однако, исследования Daniel J.