Диссертация (Роль факторов врожденного иммунитета в процессе опухолеобразования), страница 9

Данный эксперимент проводился с целью подбора оптимальных условий размер пор для дальнейших исследований по хемотаксису МНК, выделенных отздоровых пациентов, а также выделенных от пациентов с ОМЛ. Также былапоставленазадачавыявить влияниеDNA_ligнавозможную миграциюопухолевых клеток, так как ранее такие работы не проводились.По результатам серии проведенных экспериментов было выявлено, что дляисследования миграции и хемотаксиса клеточной линии К562 по направлению кDNA_lig возможно использование камеры Бойдена с порами 5 и 8 мкм, чтоподтверждается высокой достоверностью хемотаксиса через 10 и 60 минут, атакже незначительным разбросом по количеству мигрировавших клеток прииспользовании разных пор. Также выявлено, что DNA_lig подавляет хемотаксисопухолевых клеток через 10 и 60 минут.

Нами показано, что для исследованияхемотаксиса клеток линии Reh по направлению к DNA_lig камера с размерамипор 8 мкм не является оптимальным вариантом, в связи с отсутствиемдостоверности на 10 и 60 минуте исследования, а также высоким разбросоммежду мигрировавшими клетками в камере с размером пор 5 мкм и 8 мкм, чтоможет указывать на неоптимально подобранную камеру. В свою очередь дляисследования индуцированного хемотакиса по направлению к DNA_lig возможноиспользование камеры с размером пор 5 мкм в связи с высокой достоверностью.Второй этап отработки методов исследования был проведен на серииэкспериментов с использованием CXCL12 и камер Бойдена с разными размерамипор.

После проведении серии экспериментов было выявлено, что камера Бойденас размером пор 8 мкм не является оптимальным вариантом для исследованияхемотаксиса клеточных линий Reh и К562 в связи с низкой достоверностьюрезультатов. Исследования с использованием пор 5 мкм показали высокуюдостоверность в миграции обеих линий, а также, что CXCL12 частично53положительно влияет на миграцию клеток К562. Динамика хемотаксиса клетоклинии Reh под действием хемокина также растет и количество мигрировавшихклеток достоверно выше контроля.Таким образом хемокин CXCL12 положительно влияет на хемотаксисклеточных линий К562 и Reh, усиливая хемотаксис, в то время как DNA_lig дляданных опухолевых линий является ингибитором хемотаксиса.3.3 Экспрессия гена CXCL12 в клетках К562Проводя серию экспериментов по хемотаксису, мы опирались на ранеенемногочисленные проведенные исследования, в которых изучался хемотаксиснекоторых опухолевых линий лейкоза.

Большинство из них указывают наположительную роль хемокина CXCL12 в хемотаксисе и метастазированииопухолевых клеток, что также подтверждено в наших экспериментах похемотаксису опухолевых линий К562 и Reh, однако, не так давно сталипоявляться данные, что не всегда вышеназванный хемокин ведет к усилениюхемотаксису. В связи с тем, что данные по хемотаксису опухолевых клетоклейкоза разнятся в различных источниках, нами было проведено исследованиеэкспрессии факторов врожденного иммунитета в клетках К562, мигрировавшихпо направлению к CXCL12, а также в спонтанно мигрировавших клетках.Нами было показано, что хемотаксис клеток К562 под действием CXCL12значительно выше, чем миграция в контроле, в связи с чем нами была изученаэкспрессия гена CXCL12 в контроле и индуцированном хемотаксисе.

Быловыявлено, что экспрессия гена CXCL12 в мигрировавших клетках под действиемCXCL12 на 10 минуте и 60 минуте в 10 и 24 раз ниже и через 24 часа в 5 раз вышеэкспрессии в спонтанно мигрировавших образцах. (рис.7)Внашихисследованияхбылозамечено,чтодинамикамиграцииопухолевых клеток в контроле клеточной линии К562 также являетсяположительной, несмотря на то, что в нижней камере не находилосьхемоаттрактантов. Таким образом, нами была исследована экспрессия CXCL12 в54мигрировавших клетках К562.

Была выявлена высокая экспрессия гена CXCL12 вспонтанно мигрировавших клетках, а также статистически значимая прямаякорреляционнаязависимостьмиграцииотэкспрессиигена.Всвязивышеописанным можно говорить о том, что клетки лейкоза самостоятельновырабатывают достаточное количество CXCL12 для аутоактивации рецепторов идальнейшей миграции, в то время как под воздействием CXCL12 экспрессия генаданного хемокина значительно достоверно отличается от контроля, что можетуказывать на обратную отрицательную связь.Рис.7 Экспрессия гена CXCL12 в линии К562 под действием CXCL12По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 60 мин; 3 –24 часаПо оси ординат – количество копий* - показатель достоверно отличается от такового в интактных553.4 Хемотаксис мононуклеарных клеток, выделенных от здоровых доноров иот пациентов с острым миелоидным лейкозом до начала химиотерапииМиграция МНК, выделенных от здоровых доноров, по направлению кDNA_lig достоверно выше относительно контроля через 10 минут и 24 часа в 1,3и 1,8 раз соответственно.

Миграция МНК, выделенных от здоровых доноров,относительно DNA_lig достоверно ниже в 6 раз через 60 минут.(рис.8)ХемотаксисМНК здоровых доноров, по направлению к CXCL12 достоверновыше контроля через 10 минут, 60 минут и 24 часа в 1.5, 1.8 и 2.7 разсоответственно. (рис.9)Хемотаксис МНК, выделенных от пациентов с острым миеломонобластнымлейкозом, к DNA_lig достоверно не отличается от контроля на протяжении всегоэксперимента (через 10 минут, 60 минут и 24 часа).

(рис.8) Миграция МНК,выделенных от пациентов с ОМЛ до начала химиотерапии, по направлению кCXCL12 достоверно ниже контроля через 60 минут и 24 часа в 1.8 и 1.4 разасоответственно. Через 10 минут данные между миграцией по направлению кCXCL12 и контролем недостоверны. (рис.10)Миграция МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ через три недели отокончания первого курса химиотерапии, по направлению к CXCL12 достовернониже контроля через 60 минут в 1.6 раз.

Через 10 минут и 24 часа данные междумиграцией по направлению к CXCL12 и контролем недостоверны. (рис.11)56Рис.8 Динамика миграции МНК, выделенных от здоровых доноров, отпациентов с ОМЛ до начала по направлению к DNA_ligПо оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 30 мин; 3 –60 минПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).57Рис.9 Динамика миграции МНК, выделенных от здоровых доноров понаправлению к CXCL12.По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 30 мин; 3 –60 минПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).58Рис.10 Динамика миграции МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ доначала химиотерапии по направлению к CXCL12.По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 30 мин; 3 –60 минПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05)59Рис.11 Динамика миграции МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ послепроведения химиотерапии по направлению к CXCL12.По оси абсцисс – время, через которое проводили измерение мигрировавшихклеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 30 мин; 3 –60 минПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).60Рис.12 Сравнение хемотаксиса МНК, выделенных от здоровых донорови от пациентов с ОМЛ до начала и после химиотерапии по направлению кCXCL12.По оси абсцисс – время, через которое проводили измерениемигрировавших клеток: 0 – 0 мин; 1 – 10 мин; 2 – 30 мин; 3 –60 минПо оси ординат – количество мигрировавших клеток спонтанно или понаправлению к СXCL12* - показатель достоверно отличается от такового в интактных клетках(р≤0,05).61Таблица 4Показатели мигрировавших МНК, выделенных от здоровых доноров,от пациентов до и после химиотерапии.Количество мигрировавших клеток к CXCL12 через 10 минутМНК, выделенные от следующихгрупп пациентовCXCL12Здоровые (n=25)4050 #(3800 - 4600)ОМЛ до химиотерапии (n=10)1541(1300-2000)ОМЛ после химиотерапии (n=10)3900(3000- 4200)Количество мигрировавших клеток к CXCL12 через 60 минутМНК, выделенные от следующихгрупп пациентовCXCL12Здоровые (n=25)9750 #(8660-10150)1367 #(1000 – 1500)ОМЛ до химиотерапии (n=10)ОМЛ после химиотерапии (n=10)2850#(2500-3150)Количество мигрировавших клеток к CXCL12 через 24 часаМНК, выделенные от следующихгрупп пациентовЗдоровые (n=25)ОМЛ до химиотерапии (n=10)ОМЛ после химиотерапии (n=10)CXCL122850 #(2200-3050)2217 #(1960 – 2750)1050(930 – 1200)# - показатель достоверно отличается от контроля (р≤0,05).62Хемотаксис МНК здоровых пациентов по направлению к CXCL12достоверно выше хемотаксиса МНК от пациентов с ОМЛ до химиотерапии через10 и 60 минут в 2.6 и 7.1 соответственно, через 24 часа статистически значимойдостоверности нет.

Миграция МНК здоровых пациентов по направлению кCXCL12 выше хемотаксиса МНК пациентов после химиотерапии через 60 минути 24 часа в 3.4 и 2.7 раз соответственно, через 10 минут статистически значимойдостоверности нет. Показано, что хемотаксис МНК от пациентов с ОМЛ послехимиотерапии достоверно выше хемотаксиса МНК от пациентов через 10 и 60минут в 2.5 и 2 раза соответственно, и ниже в 2.1 раз через 24 часа. (табл.4)В ходесерии проведенных нами экспериментов не было выявлено статистическизначимых отличий между DNA_lig - индуцированным хемотаксисом МНК,выделенных от пациентов с ОМЛ от контроля, несмотря на то, что ранее намибыло показано, что хемотаксис клеточной линии К562 значимо снижается подвоздействием данного лиганда.

Нами предполагается, что данные различияпродиктованы в первую очередь разной степенью дифференцировки клеток –клетки линии К562 относятся к более ранним предшественникам, эритроидномиелоидным, в то время как клетки ОМЛ (М4) относятся к более поздниммиеломоноцитарным предшественникам. В связи с полученными статистическинезначимыми данными по хемотаксису клеток пациентов с ОМЛ, нами сделанвывод об отсутствии влияния DNA_lig на хемотаксис клеток в данном типелейкоза. Также нами было показано, что DNA_lig является одним из возможныхингибиторов миграции МНК от здоровых доноров.На следующем этапе была проведена серия экспериментов, направленная наисследование влияния CXCL12 на хемотаксис МНК, выделенных от здоровыхдоноров; пациентов с ОМЛ до химиотерапии и от пациентов с ОМЛ через 3недели после окончания первого курса химиотерапии.

Было показано, чтоколичество мигрировавших МНК здоровых доноров относительно CXCL12статистически значимо превышает количество мигрировавших клеток в контролена протяжении всего эксперимента, в то время как влияние хемокина нахемотаксис МНК, выделенных от пациентов с ОМЛ до химиотерапии,отрицательно и снижает хемотаксис как относительно контроля, так и63относительно хемотаксиса здоровых клеток. После воздействия химиотерапиимиграционная активность частично возвращается, но также не достигает уровнейзначения хемотаксиса МНК здоровых пациентов.В отличие от ранних исследований, сфокусированных в основном наусилении хемотаксиса злокачественных клеток хемокином CXCL12, в нашейработе было продемонстрирован противоположный эффект вышеназванногохемокина. Также не так давно канадскими учеными Luke J.