Диссертация (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект)), страница 8

Осмотр оволосения андрогензависимых зон.9. Оценка пропорций скелета (евнухоидные пропорции, сниженный рост).10. Исследование органов мошонки (пальпация и оценка объема яичек,выявление опухолей яичек, наличие семявыносящего протока и исследованиесостояния придатков яичек).11. Выявление признаков варикоцеле, проба Вальсальвы.4112. Исследование паховых региональных лимфатических узлов.13. Оценка размеров и аномалий развития наружных половых органов, в томчисле пениса (наличие гипоспадии, крипторхизма).Инструментальная диагностика.14. УЗИ яичек и органов мошонки, семенного канатика (вне зависимости отналичия или отсутствия пальпируемых образований в яичках).15.

УЗИ + допплеровское исследование вен мошонки на предмет варикоцеле.16. УЗИ трансректальным датчиком предстательной железы и семенныхпузырьков.Лабораторная диагностика.17. Клинический анализ крови.18. Биохимический анализ крови (АлТ, АсТ, билирубин, креатинин, мочевина,общий белок, альбумин), расчет скорости клубочковой фильтрации.19.Анализэякулятамикроскопическое(биохимическоеисследованиеспермы,исследованиеоценкаэякулята,лейкоцитспермии,кинезиграмма сперматозоидов, морфограмма сперматозоидов).Значения эякулята оценивались согласно протоколу Всемирной организацииздравоохранения («WHO Laboratory manual for the examination and processing ofhuman semen», 5th edition, Geneva, 2010). Семенную жидкость каждый пациентсдавал дважды, с интервалом в 22 дня.

У всех (30-ти) исследуемых мужчин позаключению спермограммы – идиопатическая азооспермия (табл. 6).20. MAR-тест или ImmunoBead-тест с целью выявления антител ксперматозоидам в эякуляте для сперматозоидов, ассоциированных с АСАТ (поВОЗ, 5-е изд., 2010 г.) – не проводили в виду отсутствия половых клеток вэякуляте (сперматозоидов).Таблица 6Результаты спермограммы во II-й группе.ПоказательЗначениеОбъем эякулята, мл≤ 1,5pH7,242Общее количество сперматозоидов, млнне обнаруженыКонцентрация сперматозоидов, млн в 1 мл–Общая подвижность сперматозоидов,%–Сперматозоидов с прогрессивным движением, %–Жизнеспособность, %–Концентрация лейкоцитов≤1 млн/млАнтиспермальные антитела (для сперматозоидов,ассоциированных с АСАТ, выявленных методами MAR,либо ImunnoBeat)исследование не проводилось21.

Гормональный анализ мужчин, страдающих бесплодием (ФСГ, ЛГ,тестостерон).За сутки до исследования исключались физическая нагрузка и приёмалкоголя. Анализ крови забирался строго натощак между 700 и 1000 часами излоктевой вены (10,0 мл). Сыворотку крови до использования хранили при –20°C. Количественное содержание фолликулостимулирующего гормона (ФСГ,FSH), лютеинизирующего гормона (ЛГ, LH) и свободного тестостерона (FTesto)определяливобразцахсывороткикровимужчинметодомиммуноферментного анализа (ELISA).

Определение концентрации ЛГ, ФСГпроизводили на автоматическом иммунохимическом анализаторе BeckmanCoulter Access-2 (США) с использованием оригинальных реактивов BeckmanCoulter; свободного тестостерона – наборами фирмы LifeSpan BioSciences(США). Чувствительность метода, коэффициент вариации (CV) и диапазонопределения (DR) составили: для ЛГ – 0,2 мЕд/мл, CV <10 %, DR – 0.2 – 250мЕд/мл; для ФСГ – 0,2 мЕд/мл, CV <10 %, DR – 0.2 – 200 мЕд/мл; длясвободного тестостерона – 0,188 нг/мл, CV <10 %, DR – 0.313 – 20 нг/мл. У всехисследуемых мужчин уровни гормонов ЛГ (10.22±0.4 мЕд/мл) и тестостерона(12.7±2.1 нмоль/мл) в сыворотке крови в пределах возрастной физиологическойнормы; количество ФСГ – 26.58±0.37 мЕд/мл (норма для мужчин 20 – 50 летсоставляет 2.0 – 11.0 мЕд/мл).4322.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) мазка из ладьевидной ямки с цельювыявления инфекций, передающихся половым путём.23. Посев эякулята на питательную среду с целью выявления патогеннойфлоры и определение чувствительности микробов к антибактериальнымпрепаратам.24.Лабораторнаяцитогенетическаяимолекулярно-генетическаядиагностика (исследование кариотипа, анализ крови на наличие микроделецийAZF локуса Y-хромосомы).

Кариотип: 46, ХY. Патологические изменениякариотипа (робертсоновская транслокация – 45,ХY,der(13;14)(q10;q10)) и другиеY-микроделеции отсутствуют.Физикальное обследование. Физическая экспертиза показала: оволосение налобке по мужскому типу; мужской голос взрослого; высота 175 – 182 см и вес68 – 84 кг. Локальное исследование: оба яичка в мошонке, обычных размеров(средний объем органа: справа – 18 мм³, слева – 20 мм³), мягкие поконсистенции и безболезненные; варикоцеле не обнаружено; семейный анамнезпо поводу варикозного расширения вен не отягощён.Все пациенты, страдающие бесплодием, являются молодыми людьми ввозрасте 22 – 35-ти лет; соматически здоровы, без вредных привычек;инфекционные заболевания, влияющие на сперматогенез (в том числе,эпидемический паротит), а также врожденные аномалии развития яичек упациентов отсутствовали.

Обследованные молодые люди имели нормальноелибидо и были сексуально активны. Аллергический и наследственный анамнезыне отягощены.Тестикулярная оценка (биопсия).Биопсия яичка была выполнена с целью выявления причины азооспермии,определения степени поражения сперматогенеза и исключения обструкциисеменных выводных протоков. Критериями для биопсии яичка были:азооспермия, сопровождающаяся нормальным или повышенным уровнем ФСГили количество сперматозоидов ≤5 млн/мл эякулята. Открытая биопсия яичкапроводилась в амбулаторных условиях с соблюдением всех правил асептики.44Биоптаты оценивали с использованием метода, описанного S.

Johnsen [87], сизменениями, внесенными J. Aafjes и соавт. [40]. Поперечные срезы семенныхканальцев были оценены со счетом от 1 до 10, на основе наиболее продвинутыхстадий сперматогенеза. Средний балл рассчитывали в 10-ти полях зрениямикроскопа (f.v.m.), при увеличении ×400. Шкала S. Johnsen (MJS): 10 баллов –сперматогенезполностьюсохранён;9–незначительныенарушениясперматогенеза – дезорганизация сперматогенного эпителия, много позднихсперматид; 8 – меньше чем пять сперматозоидов в канальце, немного позднихсперматид; 7 – отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, много раннихсперматид; 6 – отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, мало раннихсперматид; 5 – отсутствие сперматозоидов и сперматид, много сперматоцитов; 4– отсутствие сперматозоидов и сперматид, мало сперматоцитов; 3 – толькосперматогонии; 2 – отсутствие половых клеток, только клетки Сертоли; 1 –отсутствие элементов сперматогенного эпителия (тубулярная атрофия).

Ранеебыло показано, что спонтанная беременность возможна, при оценке биоптата нениже 8-ми баллов [38].В итоге, после проведения комплексного исследования (по протоколу),причины патоспермии у всех обследованных мужчин не выявлены, былвыставлен диагноз «Идиопатическая необструктивная азооспермия», всвязи чем, с диагностической целью (для окончательной верификациинозологии) пациентам было показано проведение биопсии яичка.Таким образом, была сформирована группа мужчин, учитывая следующиекритерии: необструктивная азооспермия и ФСГ ≥11 мЕд/мл.2.2.

Морфологические методы исследования яичкаМорфологическое исследование биопсийного и аутопсийного материала(тканей яичек) производили в патологоанатомическом отделении.Фрагменты яичек (1,0×1,0 см; биопат – до 1,0 см в длину) фиксировали взабуференномHCl 10% формалине⃰ (рН=7,2;от 5 до 24часов);дегидратировали в батарее спиртов восходящей концентрации (аппаратгистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments»,45Швейцария) и заливали в парафин. Срезы тканей яичка, толщиной 4–6×10-6м,помещали на обычные, а для иммуногистохимического исследования (ИГХ)– на специальные адгезивные предметные стёкла Super Frost Plus («MаinzelGlаser»,Polylisine,Германия),депарафинировалисогласнопринятойстандартной методике. Впоследствии, срезы (≈5 μm) либо окрашивалигематоксилином и эозином (H&E) для гистологического исследования илииспользовали для ИГХ.Кроме того, препараты окрашивали с использованием гистохимическихметодов: пикрофуксином по Van Gieson и Masson для выявлениякомпонентов соединительной ткани и по Weigert для оценки эластическихструктур интерстициальной ткани и стенки сосудов, а также PAS – дляобнаружения гликогена (углеводов).⃰В выборе фиксатора мы учитывали определенные характеристики химическихрастворов и специфику нашего исследования.