Диссертация (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект)), страница 9

Принято считать, что наиболее частоприменяемый способ фиксация образцов ткани яичка в растворе формалина можетвызывать выраженное сжатие ткани и связанные с этим артефакты, затрудняющиегистологическое исследование. В тоже время M. Bergmann (Evaluation of testicular biopsysamples from clinical perspective.

Andrology for the clinician. Berlin: Springer-Verlag; 2006 г.)предложил фиксировать биоптаты тканей яичка в жидкостях Bouin или Steve споследующей их заливкой в парафин. На начальных этапах настоящего исследованиятакже использовались эти фиксаторы, но был выбран формалин.

При этом,целесообразность его использования была оправдана спецификой выполняемой научнойработы, особенно для дальнейшего ИГХ-исследования.Морфометрические методы исследования яичкаОценку морфометрических (размер, вес) данных яичка в норме и припатологии производили с использованием общепринятых критериев. По ихрезультатам отмечено, что морфометрические показатели всех яичек во всехисследуемых группах в пределах возрастной нормы.Морфологическая оценка в норме (контроль) и нарушенном сперматогенезеосновывалась на результатах:1.

Морфометрический анализ извитых семенных канальцев и окружающихих тканей производили на поперечных и продольных срезах семенныхизвитых канальцев.462. Определяли относительные площадь, занятую половыми клетками икомпонентами интерстициальной ткани с кровеносными сосудами сиспользованием шкалы-микрометра (цена деления 10 мкм). Измеренияпроводили в 30 – 50 поперечных срезах каждого фрагмента яичка.Перерасчётотносительнойплощади,занятойполовымиклетками,производили на одном срезе извитого семенного канальца.Окраску срезов яичка гематоксилин-эозином производили с цельюпредварительной оценки качества (и соответственно – пригодности)материала для последующих количественного анализа и постановкииммуногистохимических реакций.2.3.

Метод непрямого иммуногистохимического анализаСпомощьюметоданепрямогоиммуногистохимическогоанализавыявляли:а) белки пролиферации и апоптоза (Ki-67, p-53, Bcl-2, caspasa-9);б) инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-I);в) маркёры эмбрионального и постнатального сперматогенеза (PLAP,CD117) для оценки функции дифференцировки половых клеток, а такжевероятнойонкологической предрасположенности при идиопатическомбесплодии;В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональныеантитела компании «Leica Biosystems Newcastle Ltd», Великобритания (табл.7)⃰.

Вторичные антитела (универсальные) – Cell Marque. Для каждого маркёравыполнялись контрольные исследования для исключения псевдопозитивныхи псевдонегативных результатов. Титр антител подбирали с использованиемраствора для разведения антител (antibody diluents).⃰ Исключения при выборе фирм-производителей первичных антител (табл. 7):1) anti-Caspase 9 antibody – кроличьи антитела (Rabbit polyclonal к Caspasa-9).Производитель – Abcam.2) Insulin-like Growth Factors-I – кроличьи антитела (Rabbit polyclonal к IGF-I).Производитель – Santa Cruz Biotechnology, Inc.47Таблица 7Иммуногистохимическое исследование (используемые антитела)Антитела(фирменноеназвание)клон, Ig-класс,фирма,разведениеСпецифичность и характеристикаБЕЛКИ – МАРКЕРЫ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА КЛЕТКИMouseClone MM1Ядерный антиген; выявляется во всехMonoclonalIgG1пролиферирующих клетках вTMAntibodyG1(поздней),S, M и G2 фазах клеточного циклаNovocastraKi-67 Antigen1:100MouseClone DO-7Ядерный антиген; определяется при остановкеMonoclonalIgG2bклеточного цикла после повреждения генома вTMAntibodyточке G1 – клетка восстанавливает целостностьNovocastraр53 Protein1:50повреждённой ДНК до деления клетки или р53запускает в клетке механизм апоптоза.MouseCloneЦитоплазматический антиген; белокMonoclonalbcl-2/100/D5внутренней митохондриальной мембраны,AntibodyIgG1который действует в качестве ингибитораTMапоптоза.Bcl-2NovocastraOncoprotein1:100Rabbit polyclonalIgGЦитоплазматический антиген внутреннего путиAntibodyапоптоза; активирует гибель ядра иAbcam1:200протеолитические процессы в клетке.caspasa-9ФАКТОРЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОКPrimary AntibodyClone 8A9Цитолеммальный антиген; в норме –IgG1визуализируется в мембранеPlacentalсинцитиотрофобласта ворсин хориона иalkalineBondTM1:100плаценты и в гонобластах/гоноцитах.phosphatase(PLAP)MouseClone T595Цитоплазматический антиген; в норме –MonoclonalIgG1обнаруживается в гонобластах/гоноцитах, аAntibody c-kitтакже в глиоцитах, тучных клетках,NovocastraTMOncoprotein1:100меланоцитах и эпителии молочной железы.Слабое окрашивание также выявили в(CD117)собирательных трубочках почек, иногда вэпителии предстательной железы и в коллоидещитовидной и паращитовидных желез.ФАКТОР РОСТАRabbit polyclonalIgG1Цитоплазматический антиген;Antibodyпоказатель пролиферативной митотическойSanta CruzInsulin-likeBiotechnology активности клеток; аутокринный/паракринный1:100стимулятор роста.Growth Factors-I48Для выявления белков использовали единую схему реакций.

Последепарафинированияиповторнойгидратации.Длявосстановленияантигенных свойств структур яичка после фиксации в формалине проводилитепловую индукцию эпитопного (ангтигенного) восстановления (HIER – heatinduction of epitope retrieval).Для этого, стёкла инкубировали в 10мМрастворе цитратного буфера (Citrate buffer 0,01M, pH≈6,0) в водяной бане смикропроцессором pT Link (Dako, Дания) (t=95ºС) в течение 40 минут ссимметричным их расположением в кювете и с последующем охлаждением вэтом же холодном растворе (t=20ºС) в течение 20 минут и промывкой в Aquadistillate (3 раза по 2´). После этого срезы на предметном стекле ограничилижирным карандашом Liquid blocker super pap pen.

Затем на каждый срезпоследовательно добавляли по одной капле Hydrogen Block Peroxidase (приt=20ºС, дважды по 5´) и Serum block на 20 минут, предварительно промыв вPBS 10x Solution (0,01M, pH≈7,4) 2 раза по 3 минуты. После этого срезыинкубировали с первичными антителами класса IgG к человеческимантигенам 7-ми исследуемых факторов в течение часа. Промывали в PBS 10хSolution(0,01M, pH≈7,4) 2 раза по 3 минуты.

Вторичные антитела –универсальные (HiDef Detectionтм HRP Polymer system, «Cell Marque»,США), позволяющие выявлять мышиные и кроличьи первичные антитела,конъюгированные с ферментным комплексом на основе пероксидазы хрена.Их наносили на срезы и инкубировали во влажных камерах на протяжении30´. Вновь промывали в PBS 10x Solution (0,01M, pH≈7,4) 2 раза по 3 минутыи инкубировали Streptavidin Peroxidase в течение 30 минут. Для детекции ивизуализации реакции (выявления комплекса антиген-антитело) добавляли накаждый срез 1 – 3 капли 3,3’-диаминобензидина пероксидазы хрена (DABSubstrateChromogen)(Novolink,LeicaBiosystems,Великобритания).Инкубировали от 30 секунд до 20´ под контролем микроскопа до появлениятемно-коричневого окрашивания специфических структур в зависимости отмаркёра (ядерная, цитоплазматическая, мембранная реакция) и промывали в49Aqua distillate в течение 2-х минут, помешивая.

Ядра клеток докрашивалигематоксилиномMayer;стеклапромывалиподпроточнойводой;дегидратировали (спирт 96%); срезы заключали в гель «Aquatex»® (aqueousmounting agent, «Andwin Science», Франция) под покровные стекла.Статистическуюобработкуполученныхданныхпроводилипообщепринятым методам медико-биологической статистики (см. ниже).Оценкаинтенсивностииммуногистохимическихокрашиванияиреакцийразделениибазироваласьнаиммунопозитивных(положительных) клеток согласно рекомендациям D.J. Dabbs «Diagnosticimmunohistochemistry» (4rd Edition, 2014) в модификации [64].Описанныевышеметодиммуногистохимическогоанализапредварительно апробировали на образцах семенников и некоторых другихорганов (лёгкие, головной мозг, сердце) белых беспородных крыс-самцов(кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета РГМУ им.Н.И.

Пирогова, заведующая – академик РАН, д.м.н., профессор О.В.Волкова).Шкала интенсивности окрашивания (качественная оценка):Степень выраженности реакции оценивали визуально в половых клеткахнаразныхстадияхсперматогенеза(сперматогонии,первичныесперматоциты, вторичные сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды).Также определяли уровень накопления белка в соматических и эндокринныхклетках яичка (табл. 8).Шкала оценки окрашивания половых клеток (полуколичественная оценка):Оценивали относительное содержание общего числа окрашенныхполовых клеток в одном извитом семенном канальце (в %).0 баллов – нет реакции – ≤1% окрашенных половых клеток в срезе;1 балл – 1 – 10% окрашенных половых клеток в срезе;2 балла – 10 – 50% окрашенных половых клеток в срезе;3 балла – ≥ 50% окрашенных половых клеток в срезе.50Таблица 8Шкала интенсивности окрашивания (качественная оценка)знаковая система оценки (+/ –)комментарий«–»нет реакцииЦветная шкала детекции⃰слабая«+»экспрессияумеренная«++»экспрессия«+++»выраженнаяэкспрессия⃰Комментарий.

Шкала интенсивности составлена на основании степени соотношения инасыщенности чёрного или белого цветов и адаптирована для оценки интенсивностиэкспрессии маркёров в структурах (клетках).Индекс экспрессии (ИЭ) оценивали в 100 клетках в 10 полях зрениясветового микроскопа при увеличении в 400 раз. Его рассчитывали поформуле:Ʃ P(i)×iИЭ = 100i – интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (нулевая, слабая, умеренная и максимальная),P(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью,100 – количество клеток.51Индекспролиферации,готовностикапоптозу,индексапоптоза,антиапоптотический индекс определяли путём подсчета количества Ki-67,каспаза-9, p53 и Bcl-2-позитивных клеток на 100 клеток соответствующихструктур во всех группах при увеличении ×40 с последующим вычислениемпоказателя в процентах.Таким образом, учитывая специфику исследуемого объекта (яички), гдеполовые клетки при световой микроскопии «перекрывают» друг друга, атакже особенность распределения внутриклеточных белков проводилиподсчёт числа иммунопозитивных клеток (в %) и оценивали степеньэкспрессии (ve +/–).Идентификация мужских половых клеток –цитологический метод исследования яичекДля идентификации мужских половых клеток на разных стадияхсперматогенного цикла (6 стадий) и фаз мейоза в частности, а также клетокСертоли в извитых семенных канальцах использовали метод отпечатковоргана (ткани).Резецированный участок яичка (1,0×1,0 см) отпечатывали на чистомпредметном стекле.