Диссертация (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект)), страница 10

Высушенный отпечаток фиксировали метанолом – 1 – 2каплинастекло.Послепромываниястёклсотпечаткомподдистиллированной водой, их окрашивали по методу Романовскому-Гимза(Д.Л. Романовский и G. Giemsa) (прилож. IV).Метод отпечатков предварительно апробировали на образцах семенниковRattus Wistar (рис.1 – 4).521234Рис. 1. Семенник Rattus Wistar, стадии мейоза. Отпечаток, окраска по G.

Giemsa ×40.1 – сперматозоид, 2 – сперматида, 3 – сперматоцит I, 4 – сперматоцит II.1234Рис. 2. Семенник Rattus Wistar, стадии мейоза. Отпечаток, окраска по G. Giemsa ×40.1 – сперматогония, 2 – сперматозоид, 3 – сперматоцит I, 4 – сперматоцит II.531Рис. 3. Семенник Rattus Wistar, стадии мейоза. Отпечаток, окраска по G. Giemsa ×40.1 – клетка Сертоли.1234Рис. 4. Семенник Rattus Wistar, стадии мейоза. Отпечаток, окраска по G. Giemsa ×40.1 – сперматида, 2 – сперматоцит II, 3 – сперматоцит I, 4 – сперматозоид.542.4.

Морфометрическое исследование сперматогенезаСрезы, окрашенные гематоксилин и эозином (H&E) изучали в стандартномсегменте стенки извитого семенного канальца (стандарт сперматогенногоэпителия), шириной до 50 мкм. На малом увеличении в центр поля зрениямикроскопа устанавливали базальный отсек семенного канальца; отмечалистандартную ширину, через концы которой условно проводили по однойлинии с каждой стороны отрезка по направлению к просвету канальца.Стадии сперматогенеза.

Стадия I характеризуется наличием округлыхсперматид, сперматогоний и сперматоцитов I. Стадия II представленасперматогониями, сперматоцитами I, сперматидами, а также резидуальнымительцами. Для стадия III характерно начало конденсации ядер сперматид ивступлением сперматогоний типа В в стадию созревания – мейоз (фазупрелептотены). На стадиях IV и V отмечаются дальнейшая конденсация ядерсперматид и первичные сперматоциты на стадии пахитены. Выявлениесперматоцитов 1-го порядка в фазу лептотены свидетельствует о стадии IV, ав фазу зиготены – стадии V. Стадия VI характеризуется наличиемсперматоцитов II.Для идентификации клеточного состава семенного канальца мы работалимикровинтом, попеременно поворачивая его по и против часовой стрелки,при увеличении светового микроскопа на ×400.

Вначале фокусировали иизучали половые клетки, а потом ядра клеток Сертоли, их топографию иморфологию (рис. 5).Подсчёт суммарного количества половых клеток в семенных канальцахпроводили на 10 строго поперечных срезах извитых семенных канальцев.Согласноданнымморфологическимсодержаниелитературыкритериемсперматогоний.сперматогонийтипаА[10,25],активностиМы(овальноеболееобъективнымсперматогенезаявляетсяпровеликоличественныйядродиффузным,санализравномернораспределенным по ядру хроматином и одним или двумя чётко очерченными55ядрышками).Мыпроизводилиподсчётпервичныхивторичныхсперматоцитов, сперматид и сперматозоидов также в 10-ти полях зренияпроизвольно взятых поперечных срезов извитых семенных канальцев.Половые клетки считали при ×400 (объектив ×40, окуляр ×10) увеличениисветового микроскопа.Одним из показателей нарушения сперматогенеза при азооспермииявляется визуализация большого количества канальцев со слущенным ивакуолизированным эпителием, заполненных отёчной жидкостью (рис.

6.).Рис. 5. Яичко. Извитой семенной каналец,сперматогенез в норме, ИГХ-реакция сантителами к Bcl-2,×40. Объяснения в тексте.←Рис. 6. Яичко. Извитой семеннойканалец при азооспермии, H&E, ×40.→Просвет семенного канальца заполненотёчной жидкостью и слущеннымиклетками; хорошо определяются зрелыеи дистрофические клетки СертолиПри азооспермии проводили анализ поперечных срезов извитых семенныхканальцев в 10 полях зрения при увеличении ×400 (объектив ×40, окуляр×10), среди которых выявляли канальцы с клетками, потерявшимиморфофункциональную связь с клетками своего клона и «слущенными» в56просвет канальца. Было проанализировано около 30-ти поперечных срезовсеменных канальцев при увеличении ×400, в некоторых определялигигантские сперматогенные одно- или многоядерные клетки, диффузнолежащие в просвете семенных канальцев с дистрофическими изменениями (ввиде фрагментированных и пикнотизированных ядер).

Производили подсчётобщего количества таких клеток.Таким образом, для подсчёта и дальнейшей статистической обработкиколичества мужских половых клеток и клеток Сертоли использовали стандартсегмента, шириной до 50 мкм в одном поперечном срезе одного семенногоканальца (рис. 11).Для подсчёта и дальнейшей статистической обработки клеток Лейдигаиспользовали стандарт периваскулярной области.В центр поля зрения светового микроскопа при увелич. ×400 помещаликровеносный сосуд (с 1 – 2 эритроцитами), соответственно диаметр его будетсоставлять около 10 – 12 мкм. От верхнего и нижнего края сосуда условнопроводили линии вверх и вниз на расстоянии до 75 мкм.

Такие же линиипроводили по боковым краям кровеносного сосуда и отступя от них на ≈100мкм, так чтобы общая длина не превышала 250 мкм (рис. 7 и 12).Рис. 7. Схема извитого семенного канальцапри идиопатическом бесплодии (мужчина22–35 лет). Измерение площади ареалаклеток Лейдига.

Окраска H&E, увеличение×40. Чёрными контурами отмечены областиподсчёта клеток Лейдига: пунктиром – поокружности кровеносного сосуда, сплошнойпрямоугольник – в периваскулярномрегионе. В центре рисунка визуализируетсякровеносный сосуд, вокруг которогогруппками располагаются клетки Лейдига(крупныеклеткисвыраженнойоксифильной цитоплазмой и круглымядром). Сверху и снизу – поперечные срезысеменных канальцев, где ближе к базальноймембране определяются ядра клетокСертоли с выраженным, округлой формыядрышком; сохранившиеся единичные сперматогонии находятся на разных уровнях; нафоне выраженного отёка обнаружены дегенеративные клетки.57Микроморфометрическое исследование яичкаАнализ морфометрии проводили с использованием модифицированнойметодики, предложенной сотрудниками ОГБУЗ «Смоленский областнойинститут патологии» д.м.н., профессором А.Е.

Доросевичем, к.м.н. К.В.Буньковым и др. [9]. При изучении параллельных срезов в произвольновыбранном участке находили гистотопографически удаленные друг от другакровеносныесосуды,чтоисключаловозможность«перекрывания»периваскулярных зон разных кровеносных сосудов.Морфометрию клеток осуществляли в одном и том же поле зрения(выбранном участке) и в каждом последующем участке (поле зрения),центром которого служили кровеносные сосуды.В каждом поле зрения измеряли площадь извитых семенных канальцев,площадь ареала мужских половых клеток, площадь интерстициальнойсоединительной ткани.

Для полного и унифицированного отображенияпреобладания одного показателя относительно другого использовали дваиндекса–канальцево-интерстициальный(Икс)игерминально-интерстициальный (Иги).Расчет канальцево-стромального индекса (КСИ):Ʃ площадь извитых семенных канальцев (мкм2)Икс = -------------------------------------------------------------------------------------площадь интерстициальной ткани (мкм2)Расчет эпителиально-стромального индекса (ЭСИ):Ʃ площадь ареала мужских половых клеток (мкм2)Иги = ---------------------------------------------------------------------------------------площадь интерстициальной ткани (мкм2)Расчёт индексов проводили в каждом исследуемом поле зрения.

Оценкаклеточных популяций подразумевала подсчёт ареала половых клетоксеменного канальца и соматических клеток в исследуемых полях зрения,центромкаждогоизполейзрения58служилкровеносныйсосуд(гемокапилляр). Для статистического анализа клеточных популяций прибесплодии взяты суммарные количества следующих элементов яичка:1) сперматогонии;2) клетки Сертоли;3) клетки Лейдига.Морфометрическое исследование аутопсийного и биопсийного материаловвыполняли на светооптическом микроскопе «Carl Zeiss Lab.A1» (Carl Zeiss,Германия), совмещённом с видеокамерой «AxioCam ERc5s» (Carl ZeissMicroscopy GmbH, Германия) и программным обеспечением ZEN Lite.Документирование результатов осуществляли при помощи компьютернойпрограммы «Видео Тест 4.0.

Морфология» (г. Санкт-Петербург), площадькаждого поля зрения при данном увеличении микроскопа ×400 (объектив×40, окуляр ×10) составила ≈96238 мкм2.Последовательность микроморфометрии и обработки изображения1. Изображения, полученные в полях зрения микроскопа, обрабатывали спомощью фильтров программы, где по заданным параметрам (площадьобъекта, цветовая гамма, размеры по осям Х, Y, яркость, оптическаяплотность и другое) производили измерение объектов (согласно «маске»).2.

В нашем случае измерение площади исследуемых структур проводилипри увеличении ×400 (объектив ×40, окуляр ×10), измеренные объектывыдавались в реальных величинах (мкм). На основании параметровувеличения проводили калибровку.3. Для измерения площади интерстициальной соединительной ткани напанелиинструментоввыбиралиопцию«выделениепоконтуру»,позволяющую обводить интересующий нас контур, в частности площадь,приходящуюсянамежканальцевуюсоединительнуюткань,площадьпросвета сосудов (капилляров) в центре каждого поля зрения. В итогеполучали интересующий нас параметр морфометрического исследования –59площадь (S) (рис.