Диссертация (Морфологический анализ сперматогенеза - основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект))

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА (СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)На правах рукописиДЕМЯШКИНГРИГОРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СПЕРМАТОГЕНЕЗА –ОСНОВА ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОГОИДИОПАТИЧЕСКОГО БЕСПЛОДИЯ(ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ)14.03.02. – Патологическая анатомияД И С С Е Р Т А Ц И Яна соискание учёной степени кандидата медицинских наукНаучный руководитель –доктор медицинских наук,профессорЕвгения Алтаровна КОГАНг. Москва2017 г.1Моей семье посвящается….“… I know the price of success: dedication,hard work, and an unremitting devotion tothe things you want to see happen…”Frank Lloyd Wright«Я знаю цену успеха: настойчивость, упорный труд ибезраздельная преданность тому, чего вы хотите добиться»Г.

Демяшкин2ОГЛАВЛЕНИЕВведение………………………………………………………………………….4Глава 1 (I). Сперматогенез (обзор специализированной литературы)1.1. Мужское идиопатическое бесплодие…………………………………...151.2. Центральные механизмы регуляции сперматогенеза ………................191.3. Клетки Сертоли …………………………….……………………...…….201.4. Мужские половые клетки ………………………………………….…....261.5. Маркёры иммунофенотипирования структур яичка в норме и припатологии ……………………………………………………………………...35Глава 2 (II). МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …..…..…..392.1. Клиническое обоснование мужского идиопатического бесплодия ......412.2. Морфологический метод исследования …………………………….…..462.3. Метод непрямого иммуногистохимического исследования ……….….482.4. Морфометрический метод исследования ………………………….……562.5.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ……..….642.6. Статистические методы и обработка данных ………………………... ..65Глава 3 (III). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ….673.1. Морфофункциональное исследование структур яичка у мужчинв возрасте 22 – 35 лет в норме ……………………………………………673.2. Морфофункциональное исследование структур яичка у мужчинв возрасте 61 – 74 лет в норме ………………………………….……..….753.3.

Морфофункциональное исследование структур яичка у мужчинв возрасте 22 – 35 лет при идиопатическом бесплодии …………………803.4. Статистический анализ …………………………………………………....87Глава 4 (IV). ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ(Протеомика сперматогенеза) ………………………………………………101ЗАКЛЮЧЕНИЕ ………………...……………………………………...………112ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………119ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….120ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ …………………………..……..121СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………...…….122ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………………...…...…….1413ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемыС каждым годом прослеживается неуклонный рост частоты мужскогобесплодия как в России, так и в других странах Мира при сопутствующейнизкойэффективности распознаванияОбъяснениемэкологическойростабесплодияобстановки,причинслужат:оказывающейидиопатическихпрогрессивноесущественноеформ.ухудшениевлияниенарепродуктивное здоровье населения, повторяющиеся экономические кризисыи потрясения, негативно влияющие на психику человека, массовоеупотреблениенекачественныхпродуктовилекарств,содержащихмалополезные и даже вредные ингредиенты, неблагоприятная радиационнаяобстановка на Планете из-за аварийна Чернобыльской и Фукусимскойатомных станциях, сомнительное качество морепродуктов из-за нарушенияэкологии моря, ухудшение состояния атмосферы по причине вредныхвыбросовидр.Перечисленныефакторынегативновлияютнарепродуктивную систему, в том числе (что в высокой степени вероятно иопасно), – на дифференцировку мужских половых клеток.

О состояниирепродуктивного здоровья мужской части населения свидетельствуютданные ряда исследований. Около 30% всех случаев мужского бесплодиясоставляют идиопатические формы, причины которых не выяснены и непонятны (Брагина Е.Е. и соавт., 2002; ВОЗ, 1992, 2000) [8, 27]. По мнениюРайцинойС.С.(1969),Астраханцева А.Ф. (2011),КаганаС.А.(1985),А.И.Лысенко(2008),Курило Л.Ф. и соавт. (2000) [2, 17, 20, 31],совокупность нейро-эндокринных и локальных механизмов составляетрепродуктивную стратегию защиты генома развивающихся половых клеток[7, 8, 16, 20] и до 20% случаев нарушений мужской репродуктивной системысвязаны с количественными или структурными аномалиями хромосом.

Неттакже единогласия в отношении этиологии, патогенеза, диагностики илечения мужского бесплодия [13, 14, 19]. Актуальность проблемы мужского4бесплодия становится все более значимой и требует новых современныхнаучныхразработок,способныхконкретизироватьведущиепатогенетические звенья в развитии той или иной формы бесплодия.Анализ отечественной и зарубежной научной литературы по этиологии ипатогенезу мужского бесплодия свидетельствует о дефиците информации.Существенным недостатком в подходе к проблеме является то, чтобольшинство исследований выполняются на экспериментальных животных иэкстраполировать их результаты на человека не правомерно.

Более того,экспериментальный подход к изучению идиопатической формы бесплодия умужчин не приемлем – ибо в этих случаях должен анализироватьсяисключительноклиническийматериал,чтоневсегдаоказываетсявозможным.Как известно, в физиологии половых желез (не только мужских, но иженских) существует тесная связь между генеративной и эндокриннойфункциями – если страдает одна из них, вторая, как правило, не бываетполноценной.

Результаты исследований последних десятилетий (ВолковойО.В. и Боровой Т.Г.) значительно расширили рамки понимания эндокриннойактивности половых желез [11, 12, 26, 37]: сегодня эта функцияпредставляется более широкой и включает не только образование и секрециюполовых стероидных гормонов, но и выработку множества другихбиологически активных соединений, источниками которых в половыхжелезах являютсяклетки-эндокриноциты, сами половые клетки, клеткиСертоли и даже клетки стромы, не принадлежащие к категории эндокринных.Все выявляемые биологически активные вещества способны эффективновлиять на гаметогенез; их влияния, конечно же, подконтрольны центральнымнейро-иммуно-гуморальныммеханизмамидействиюгормоновпериферических эндокринных желез, однако роль местных факторов можетбыть настолько значимой, что даже при сохранной экстрагонаднойрегуляции, нарушения внутригонадных звеньев могут иметь крайне5негативные последствия для сперматогенеза.

Кроме того, мало изучена рольметаболитов распадающихся клеток, которые возможно также выступают какаутокринные и паракринные регуляторы (Ярыгин К.Н., Холоденко И.В.,Скворцова В.И. и др., 2009) [38]. Таким образом, мужские половые железыотносятся к динамичным системам организма, характеризующимся не толькосложностью происходящих в них морфогенетических процессов [11, 12], нои многообразием механизмов регуляции функций. Сперматогенез протекаетпод контролем специфических генов развивающихся гамет и регулируетсясовокупностью гормонов, цитокинов, факторов роста, синтезируемых как ворганах самой половой системы, так и вне её [8, 10, 11, 12, 37].Несмотря на совершенствование методов диагностики с каждым годом вразвитых странах прослеживается неуклонный рост мужского бесплодия ввиде азооспермии (секреторная и обструктивная формы).

При азооспермиидиагностически наиболее доказательным является гистологический анализбиопсийного материала тканей яичка, выявляющий степень пораженияполовых клеток, а также возможный риск малигнизации. Используемые напрактике критерии оценки степени поражения половых клеток былиразработаны ещё в 70-х годах прошлого века (критерий Johnson, De Kretser,Holstein), поэтому они нуждаются в модернизации с учётом современныхметодов морфологического исследования.Без глубокого познания факторов, воздействующих на мужскую половуюжелезу и оказывающих позитивное либо негативное влияние на егосперматогенную и эндокринную функции, невозможно решать вопросымужского бесплодия, в том числе,– идиопатических форм, и, соответственно,вести поиск путей лечения в правильном направлении.

Широкая перспективав исследовании морфофизиологии половых желез открылась с внедрениемметодов иммуноцито- и иммуногистохимии, которые позволили адресноисследовать in situ процессы синтеза разных биологически активныхмодуляторов гаметогенеза.

Имеющиеся в мировой литературе результаты6исследований указывают на важнейшее значение пара- и аутокринныхфакторов яичек и яичников в реализации мужского и женского гаметогенеза.Однако в проблеме идиопатических форм мужского бесплодия возможностииммуногистохимическогометодадоконцанереализованы,крайненедостаточно работ в этом направлении проводится как в России, так и зарубежом.Комплексноеизучениеособенностейфизиологическогосостояниямужских половых клеток, эндокриноцитов и клеток стромы яичек приданной патологии, несомненно, способствовало бы прогрессу знаний вобласти патогенеза идиопатических форм мужского бесплодия и такоеизучение может быть проведено в том числе при использованиикомплексного иммуногистохимического анализа, охватывающего общие испецифические аспекты метаболизма всех клеточных компонентов извитыхсеменных канальцев и интерстициальной ткани семенников.Цель исследованияВыявление патоморфологических и молекулярных механизмов нарушениясперматогенеза при идиопатическом бесплодии.Задачи исследования:1.

Оценить активность иммуногистохимического маркирования мужскихполовых клеток и соматических клеток яичек на факторы пролиферациии апоптоза (Ki-67, Bcl-2, p53, каспазы-9), факторы дифференцировки(PLAP, CD117) при идиопатическом бесплодии (при необструктивнойазооспермии).2. Провести сравнительный иммуногистохимический анализ перечисленныхвыше факторов в структурах яичек лиц молодого и пожилого возрастов,отметив сходство и/или отличия от аналогичных показателей приидиопатическом бесплодии.3. Выявить степень активности инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-I)в мужских половых клетках, клетках Сертоли и клетках Лейдига в норме7и при идиопатическом форме мужского бесплодия с использованиемиммуногистохимического метода.4. Определить степень экспрессии генов-регуляторов клеточного цикламужских гамет при идиопатическом бесплодии (проапоптотические BAKи BAX и антиапоптотические BCL2 и BCLW).5.