М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе

УДК 577ББК 28.072М42Рекомендовано к опубликованию решением Ученого и Учебно-методича ко,‘исоветов биологического факультета МГУ имени М.В. ЛомоносоваРецензенты:Гривенникова В.Г., кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимиибиологического факультета Московского государственного университетаимени М.В. ЛомоносоваЕвстафьева O.JI. , кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимииГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологическийуниверситет Федерального агентства по здравоохранению и социальномуразвитию.Медведева М.В., Гусев Н.Б.Определение концентрации белка в растворе: Учебно-методическоепособие.

- 2-е изд. - М.: Цифровичок, 2012. - 44 с.ISBN 978-5-317-03318-7Пособие в первую очередь предназначено для студентов 3-го курсакафедр биофизики, биоинженерии, иммунологии, физиологии человека иживотных, генетики и клеточной биологии и гистологии, выполняющихпрактические работы в рамках раздела «Современные методы биохимии».Оно также может быть полезно для обучения студентов других кафедрбиологического факультета МГУ, осваивающих навыки практическойбиохимии.Учебно-методическое пособиеМЕДВЕДЕВА Марина ВалерьевнаГУСЕВ Николай БорисовичОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В РАСТВОРЕISBN 978-5-317-03318-7© Медведева М.В., Гусев Н.Б., 2010© Медведева М.В., Гусев Н.Б., 2012ОГЛАВЛЕНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................... 4ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ................................................................................51.

С пектроф отометрические методы определенияконцентрации белка........................................................................................ 51.1. Спектрофотометрический метод определения концентрациибелка по поглощению в ближней ультрафиолетовой области(280 нм)...............................................................................................................61.2. Спектрофотометрический метод определения концентрациибелка по поглощению в далекой ультрафиолетовой области(205-240 нм).......................................................................................................

92. К олориметрические методы определения концентрации белка... 122.1. Биуретовый метод........................................................................................... 142.1.1. Макрометод.2.1.2. Микрометод.2.2. Метод Лоури и соавторов.............................................................................. 192.2.1. Стандартный метод.2.3. Определение концентрации белка с бицинхониновой кислотой......... 232.3.1. Стандартный метод.2.3.2. Микрометод.3. О пределение концентрации белка колориметрическимиметодами по связы ванию красителей.................................................... 263.1.

Определение белка по связыванию Кумасси (метод Бредфорд).......... 273.1.1. Стандартный метод.3.1.2. Микрометод.3.2. Определение белка по связыванию амидового черного (методШаффнера и Вайсмана).................................................................................314. Ф луоресцентны е методы определения концентрации белка.........334.1. Определение концентрации белка с флуорескамином........................... 344.2.

Определение концентрации белка с о/7/ио-фталевым диальдегидом ..37ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ........................................................................................ 39Семинар.................................................................................................................... 39Практическая работа..............................................................................................40ОФОРМЛЕНИЕ ЗАДАЧИ......................................................................................... 453СПИСОК СОКРАЩЕНИЙВСА - бычий сывороточный альбуминЬХК - бицинхониновая кислотаДМСО - диметилсульфоксидДСП - додецилсульфат натрияГрис - 3-гидроксиметиламинометанТрицин - трис(гидроксиметил)метилглицинХепес - Лг-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы’-этан-сульфоновая кислотаЧСЛ человеческий сывороточный альбумин')1'ТА - этиленгликольтетраацетат')ДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота4ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕУмение правильно определить концентрацию белка (и, соответственно,его количество) - одна из наиболее важных задач на начальном этапеобучения биохимии.Существует множество методов определения содержания белка как врастворе, так и в других биологических материалах.

В данном методическомпособии мы ограничимся рассмотрением наиболее часто используемыхметодов определения концентрации белка в растворах.1.Спектрофотометрическиеконцентрации белкаметодыопределенияСогласнозаконуБугера-Ламберта-Бера(1)светопоглощение(абсорбция) или оптическое поглощ ение А (иногда оптическое поглощениеобозначается как D или Е) определяется соотношением междуинтенсивностью подающего (10) и прошедшего через поглощающий раствор(I) монохроматического излучения:A = lg (I o /I )(1)Величина А характеризует степень ослабления интенсивности света,пропущенного через раствор, и линейно зависит от концентрациипоглощающего вещества в растворе, толщины поглощающего слоя иоптических свойств поглощающего вещества в определенном растворителеи при определенной длине волны.

В свою очередь оптические свойствавещества характеризуются коэффициентом поглощения (коэффициентомэкстинкции) (2). Для того чтобы вещества было удобнее сравнивать междусобой по поглощающим свойствам, используют коэффициенты молярногопоглощения(молярнойэкст инкции).Коэффициентмолярногопоглощ ения (е) - величина оптического поглощения 1 М раствора при длинеоптического пути (I) (толщине поглощающего слоя) 1 см. Тогда величину Аможно записать как:гдеА = £• С* 1е - коэффициент молярного поглощения (М '^см '1)С - концентрация раствора (М)1- длина оптического пути (см)(2)Из формулы (2) следует, что, зная длину оптического пути и коэффициентмолярного поглощения (справочные данные), и измерив оптическоепоглощение, можно определить молярную концентрацию раствора.

Чемвыше величина коэффициента молярного поглощения, тем выше5чувствительность спектрофотометрического определения концентрациивещества.Часто, когда величина коэффициента молярного поглощения довольнобольшая, а концентрацию раствора удобнее определить в мг/мл, используюткоэффициент весового (удельного) поглощ ения А 0,1". Эта величинахарактеризует оптическое поглощение 0,1%-ного раствора (масса/объем) вопределенном растворителе при определенной длине волны.

Тогда поформуле (2), измерив величину оптического поглощения, можно определитьконцентрацию раствора в мг/мл, поскольку:0,1% раствор:0,1 г в 100 мл раствора, или0,001 г = 1 мг в 1 мл раствораКонцентрацию белковых растворов чаще определяют в мг/мл, используякоэффициент удельного поглощения.При измерении оптического поглощения следует помнить, чтодостоверными являются значения 0,2-0,8 единиц оптического поглощения(при очень малых и очень высоких величинах оптических поглощенийвелика ошибка измерения).1.1.

Спектрофотометрический метод определения концентрации белкапо поглощению в ближней ультрафиолетовой области (280 нм)Принцип метода. Метод основан на способности ароматических остатковаминокислот (триптофана, тирозина и в гораздо меньшей степенифенилаланина) поглощать свет в длинноволновой ультрафиолетовой областиспектра (вблизи 280 нм) (Рис. 1). Определенный (хотя и незначительный)вклад в поглощение при 280 нм вносят также дисульфидные связи.В связи с тем, что белки довольно сильно различаются по содержаниюароматических аминокислот, величина поглощения при 280 нм для растворабелка с концентрацией 1 мг/мл может варьировать в диапазоне от 0 (длябелков, не содержащих остатков ароматических аминокислот) до 4,0 (длянекоторых богатых тирозином белков шерсти). В среднем коэффициентыудельного поглощения белков составляют от 0,5 до 1,5. Поэтому, принятосчитать, что раствор «усредненного» белка (или смесь белков) сконцентрацией 1 мг/мл при 280 нм обладает поглощением, равным 1,0.Теоретически рассчитанные величины коэффициентов весового поглощенияиндивидуальных белков можнонайтив базе данных UniProt(http://www.expasv.ch ) или рассчитать по формуле:А 280 (мг/мл)= (5690 • nw+1280 • пу+120 • пс)/Мгде(3)А28о (мг/ мл) - коэффициент удельного (весового) поглощения(поглощение раствора с концентрацией 1 мг/мл)М - молекулярная масса белкаnw- количество остатков триптофана6пу- количество остатков тирозинапс- количество остатков цистеинаЦифры, стоящие перед этими членами, соответствуют молярнымкоэффициентам поглощения соответствующих аминокислот.£, М '^ с м 'Д ли н а волны, нмРис.

1. Спектры поглощения ароматических аминокислот (тирозина,триптофана, фенилаланина) в ультрафиолетовой области спектра.(http://www.carnpbell.edu/facultv/nemecz/323 lect/amino/imeges/spectrum.jpg).В том случае, если исследуемый образец белка содержит нуклеотидыи/или нуклеиновые кислоты, также поглощающие в ультрафиолетовойобласти с максимумом поглощения при 260 нм, концентрацию белка можноопределить, измерив оптические поглощения раствора при 280 нм (максимумпоглощения белка) и при 260 нм (максимум поглощения нуклеотидов инуклеиновых кислот) и используя эмпирическую формулу Калькара (4):С = 1,55 • Агво ~ 0,76 • А 260где(4)С - концентрация белка (мг/мл)А28о и А26о- величины оптического поглощения, измеренные при280 и 260 нм, соответственно7Для учета вклада нуклеиновых кислот и нуклеотидов можновоспользоваться измерениями оптического поглощения также при другихпарах длин волн и формулами (5) и (6), например:С - 2,51 • (А 235-А 280)илиС = 0,183 • А230 - 0,0758 • А260(5)( 6)Измерение оптического поглощения белкового раствора в ближнейультрафиолетовой области.